出血毒素是主要的血循環毒素，能引起動物水腫、出血和組織壞死。這種毒素廣泛存在於蜂蛇毒和響尾蛇毒中，眼鏡蛇科只有眼鏡王蛇蛇毒含有出血毒素，海蛇毒中至今還沒有發現有出血毒素。響尾蛇毒和蝰蛇毒以能引起較强的局部效應著稱，這種局部效應包括水腫、出血和組織壞死，它們無一不與其中的出血毒素有關。由於這種局部病理變化出現速度快，往往來不及施以抗血清治療，囙此很難治療。這種病變往往使蛇傷病人的肢體壞死，有時不得不截肢，是蛇傷治療中的一大難題。響尾蛇毒和蝰蛇毒引起出血作用的强弱依不同蛇毒及劑量大小而有變化，弱者只是引起傷口或注射部位皮內或皮下少量出血；較重者可以引起傷口或注射部位附近組織或肌肉大面積出血；嚴重者不但傷口或注射部位出血，而且可引起內臟器官（如肺、肝和腸等）廣泛出血。在這種情況下出血毒素的出血作用是導致動物死亡的主要原因。
一、分離和純化
由於出血毒素能引起嚴重病理變化，已經引起人們廣泛的重視，但與對神經毒素的認識相比，仍然十分膚淺。這一方面由於出血毒素的分子量較大，而且有的還含有其他組分如碳水化合物等，給分離純化帶來一定的困難。事實上只是在近代層析科技被應用於蛋白質分離後，對出血毒素的分離純化才成為可能，而神經毒素特別是突觸後神經毒素有時僅經沉澱就可以部分純化。另一方面是大多數出血毒素都不太穩定，並具有蛋白水解酶活性，在純化過程中可以自動降解，這使分離出的出血毒素很難達到十分單一。
過去對出血毒素的分離多以下列4種蛇毒為資料，它們是：日本蝮蛇、美州矛頭蝮{Bothropsjararaca）、黃綠恪鐵頭（J’rimeresurusflavoviridis）和巴勒斯坦蝰蛇。最初從蛇毒中分離出2種出血毒素，分別稱為HR，和HR2。這2種毒素也是最早從蛇毒中分離出的2種出血毒素，它們都具有酪蛋白水解酶的活性。以後進一步發現HR2是由2種出血毒素組成的，可以通過Bio-Rex70柱層析分成2種出血毒素，分別稱為HR2i^HR2b，實際上HR2b仍不够純。最近Yanaha等對HR2b進行了進一步純化，純化後的HR21^5超高速離心和SDS-PAGE測定為純蛋白，用SephadexG_75和SDS-PAGE測定所得的分子量分別為18000和18500，這說明HR2b是一種單體結構的蛋白質。Yanaha已經得到HR2b的晶體，晶體為薄片狀結構，這是至今為止得到的惟一出血毒素晶體。由於沒有獲得單晶，所以還不能對其三維結構進行X光繞射。不管是HR2a還是HR2b都無蛋白水解酶活性，也無其他酶活性。Oshima等（1972）從蛇毒中分離出2種出血因數，分別命名為HR-I和HR-I。HR-I既無蛋白水解酶活性也無其他酶活性；HR-I具有蛋白水解酶活性，但特性與胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰肽酶不同，它能够破壞舒緩激肽。從蛇毒中只分離出一種出血毒素HF2，該毒素具有酪蛋白水解酶活性。
Grotto等（1967）先從蛇毒中分離出一種酸性出血毒素，後來Ovadia等（1978）又從中分離出另外2種出血毒素，現把該毒中的3種出血毒素分別稱為HR1.HR2和HR3，其中HR3無蛋白水解酶活性，而和HR2的蛋白水解酶活性很强。
近幾年來對西部菱斑響尾蛇、尖吻複和東部菱斑響尾蛇（C.蛇毒中出血毒素的分離工作做得比較多。繼Nikai（1982）和Sugihara從臺灣產尖吻蝮蛇蛇毒中分離出4種出血毒素後，Mori等（1984）又從該毒中分離出一種出血毒素，命名為Ac5-proteinase，過去分離的4種出血毒素分別稱為Ac！-proteinase、Ac2-proteinase、Ac3-proteinase、Ac4-proteinase。分離出的Ac5-proteinase在pH4.3條件下進行聚丙烯醯胺凝膠電泳和SDS-PAGE測定為純蛋白。
除Ac4-proteinase無致死活性夕蔔，其他4種出血毒素都兼有致死活性。Ac3-proteinase含有小量的碳水化合物（0.1%W/W），其他4種出血毒素都不含碳水化合物。5種出血毒素的活性都能被EDTA、鄰-菲咯啉和半胱氨酸抑制。它們的分子量從AC2-pr0teinase〜Ac5-proteinase分別為24OOO、25000、57000、33000和24000»徐洵等（1981）對中國皖南產尖吻蝮蛇毒中的出血毒素進行純化，共分離出3種出血毒素，分別命名為AaHI、AaHI和AaHI，與臺灣產尖吻蝮蛇毒中的出血毒素相比，沒有二種出血毒素之間絕對相同的，它們之間確切的關係還需要進一步研究。Bjarnason和Tu（1978）以及Nikai等（1984）從afmr蛇毒中分離出6種出血毒素，分另丨〗命名為出血毒素a、b、c、d、e和f。Nikai純化的出血毒素f和前5種出血毒素一樣，都含有1個Zn2+。出血毒素f由572個胺基酸組成，分子量為64000，它不但能水解胰島素B鏈，而且還能水解纖維蛋白原的T鏈，但不影響Aa和Bp鏈，所以不能使纖維蛋白原成為纖維蛋白凝塊。出血毒素f因數在免疫特性方面與其他幾種出血毒素不同，它具有致死活性，不但能引起局部出血，而且能引起內臟廣泛出血。從Crofa/ws加ews蛇毒中只分離出一.種出血毒素，命名為ProteinaseH。這種毒素可能是該蛇毒中惟一的一種出血毒素，因為它的出血活性與粗毒的出血能力相當。ProteinaseH為單鏈糖蛋白，分子量為85700，具有酪蛋白水解酶活性，但不能水解精氨酸酯。EDTA可以抑制其出血和蛋白酶水解活性，被抑制後的出血毒素不能通過對Ca2+或Znh透析使活性恢復，有趣的是用苯甲磺醯氟處理可使活性恢復。a2-球蛋白是許多蛋白酶的抑制劑，用該球蛋白與ProteinaseH—起溫育不能抑制其蛋白水解酶活性。Huang等（1984）對從棕點竹葉青蛇毒中純化的出血毒素I（HR！）的性質進行了研究，並純化出了出血毒素I（HR2）。用SDS-PAGE法測定HR2為純蛋白，分子量為81500，含糖10%，由669個胺基酸組成，單肽鏈；只艮分子量為23500，由203個胺基酸組成。HI^和HR2都能水解纖維蛋白原、酪蛋白和合成底物，HR，的水解活性比HR2高得多。它們都不能水解TAME，也無PLA2活性。（3-巰基乙醇、抗血清能抑制它們的出血活性。EDTA能徹底抑制HR:的出血活性、纖維蛋白原溶解活性和酪蛋白水解活性。ED-TA也能够徹底抑制HR2的酪蛋白水解活性和纖維蛋白原溶解活性，但只能部分抑制其出血活性。加Zn2+（15mmol/L）可以使HR，出血作用恢復，但加Zn2+不能使HR2的出血活性恢復，這兩種出血毒素都含有Zn2+。HR，的出血活性可能與它的蛋白水解酶活性有關，而HR2的出血活性可能與蛋白水解酶活性無關。Mandelbaum等（1984）從諾維特矛頭蝮蛇毒中分離出2種出血毒素，稱為NHFa和NHFb。它們都是酸性蛋白，等電點在4.2〜4.3範圍內，都由一條肽鏈組成，分子量分別為46000和58000；NHFb的出血活性比NHFa大23倍，而NHFa的酪蛋白水解活性比NHFb高20倍；它們都是金屬蛋白酶，都能被EDTA和1,10-菲咯啉抑制；NHFa和NHFb在抗原性方面十分相近，如果用抗B粗毒的馬血清做試驗，二種毒素的抗原性相同，但如用抗粗毒的家兔血清做試驗，二者的抗原性有一定的差別。
除上述蛇毒外，一些學者還對其他一些蛇毒中的出血毒素進行研究。Mebs等（1982）從_喹anWans）蛇毒中分離出一種出血毒素，該毒素無酪蛋白水解活性，也無精氨酸醋酶活性，但有致死活性，其半致死劑量為1.6mg/kg。Sanchez等（1987）從Z.
蛇毒中分離出一種出血因數，命名為LHF-I。該因數為糖蛋白，用SDS-PAGE測定分子量為100000。它的出血活性與本身的酪蛋白水解活性有關。Sugihara等（1983）從產於中國的烙鐵頭蛇毒中分離出一種出血毒素，命名為Mucrotox-inA。該毒素分子量為94000，等電點4.3，含有3個Ca2+和2個Zn2+，不含糖。該毒素不能水解酪蛋白，也不具有致死活性。Kishida等（1985）進一步研究發現，它雖不能水解酪蛋白，但能水解二甲醯酪蛋白、胰島素B鏈和纖維蛋白原。水解纖維蛋白原時先作用A（a）鏈，然後再水解B（p）鏈，但產物不能形成纖維蛋白凝塊，這說明該毒素水解A（«）鏈和B（P）鏈的部位與凝血酶不同。MucrotoxinA能引起內臟廣泛出血。Ovadia等（1987）從A-⑶蛇毒中分離出一種出血毒素，該毒素分子量為50000，為酸性蛋白。純化的出血毒素的出血活性是粗毒的12倍。該出血毒素在pH6〜9範圍穩定，在PH5.0或pH9.5時活性下降一半，在56℃條件下溫育15min活性喪失。沒有測出該毒素具有蛋白水解酶活性，它不能水解酪蛋白、明膠和合成底物。出血活性可以被EDTA抑制，而且不能通過加Ca2+或Zn2+恢復，也可以被蛇的血清中和。抗巴勒斯坦蝰蛇蛇毒的血清也可以中和該出血因數的出血作用，用免疫擴散檢查發現有一條沉澱線，說明這兩種蛇毒的出血因數有相似的抗原性。蛇毒與抗眼鏡蛇毒血清產生廣泛的沉澱反應，對其他三類蛇毒血清也有弱的沉澱反應。Civello等（1984）從響尾蛇蛇毒中分離出一種出血毒素，命名為出血蛋白酶IV。這種出血毒素經胰蛋白酶和從該毒中分離的另一種蛋白酶I處理，其活性不變，但處理後的出血蛋白酶IV經SDS-PAGE測定發現有部分被水解。
眼鏡蛇毒一'般不含出血毒素，也不含內狀酶，但眼鏡王蛇蛇毒比較特殊。Weissenberg等（1987）用SephadexG-75對該毒進行凝膠過濾，分出幾個蛋白峰，其中峰1具有蛋白酶活性，但只有部分的組分有出血活性。粗毒和峰1的蛋白質都能水解酪蛋白和BAEE，還具有舒緩激肽釋放酶的活性，但都不能水解膠原蛋白和明膠。該蛇毒的出血毒素較特异，它的出血作用依不同動物而不同，以家兔和野兔為實驗動物時，該毒無出血作用，但能引起小鼠、大白鼠和家鴿出血。
有（或很弱）蛋白酶活性。由於這種偶合，使人們在這個問題上徘徊了半個世紀，只有在對許多出血毒素進行純化後，才有了較正確的認識。現在看來出血毒素的出血作用與蛋白水解酶活性並沒有必然的聯系。首先，蛇毒中有許多蛋白水解酶，但大部分的蛋白水解酶沒有出血活性；其次，自然界某些非蛇毒組分如細菌膠原酶等，雖然沒有蛋白水解酶活性，但也有出血作用。蛇毒的出血毒素有些有蛋白酶活性，如蛇毒中分離出5種出血毒素，其中出血毒素a的出血活性較大，但蛋白水解酶活性卻最小。Grotto（1967）從蛇毒中純化出的1種出血毒素具有明膠水解酶的活性，大豆胰蛋白酶抑制劑或DFP可以抑制它的明膠水解酶活性，但不影響它的出血作用，這說明兩種作用可以分開。Park（1961）認為出血作用和明膠水解作用由毒素的兩個活性部位分別承擔，抑制劑抑制了活性中心的明膠水解活性部位，從而引起酶活性的喪失。Ohsaka（1960）較先從蛇毒中分離出不具蛋白水解酶活性的出血毒素。他把從蛇毒中初步純化的HR2通過Bio-Rex70柱層析分成2種不具蛋白水解酶活性的出血毒素HR2a和HR2b。Ovadia（1978）從蛇毒中分離出的出血毒素HR3幾乎沒有蛋白水解酶活性，只有弱的明膠水解酶活性。除此之外，0shima（1972）從蛇毒中分離的出血毒素HR-I以及最近Mebs（1982）從Bfrisanrtans毒中分離的出血毒素也沒有水解酶活性。能够引起出血的動物毒除蛇毒外還有蜘蛛毒、蠍毒及壁虎毒，而它們有些沒有蛋白水解酶活性。例如蜘蛛毒可以引起腸道出血，但並未發現該毒中含有蛋白水解酶，暗示它的出血作用與蛋白水解活性無關。還有部分學者認為出血活性和蛋白水解活性密不可分，他們的主要證據有以下幾個方面：首先，在提純的出血毒素中所謂沒有蛋白水解活性的出血毒素極少；其次，幾乎所有的出血毒素蛋白水解酶活性被EDTA等抑制時它們的出血作用也都消失，這說明二者的關係十分密切；再次，現有測定蛋白水解酶活性的方法不够靈敏，所用的酪蛋白-三氯醋酸沉澱方法只能測定對酪蛋白的水解作用，而且是活性較大的出血毒素，而那些對酪蛋白無水解活性的或特异性較小但對其他底物能水解的出血毒素卻無法進行測定。這方面的例子不少，例如從烙鐵頭蛇毒中純化出的出血毒素不能水解酪蛋白，但它能水解甲醯化的酪蛋白、胰島素B鏈和纖維蛋白原，又如蛇毒中的HR3雖不能水解酪蛋白，但能水解明膠。即使最沒有蛋白酶活性的HR2a和HR2b也能作用於分離的毛細血管基底膜並釋放出肽和多糖。基底膜主要由膠原蛋白以及其他與多糖結合的蛋白質組成，HR2a和HR2t可能被某些因數啟動，直接對基底膜中的蛋白底物進行作用。
出血毒素另外一個顯著的特點是含有金屬離子，其出血活性和蛋白水解酶活性能被EDTA等金屬熬合劑抑制。過去對粗毒的研究表明，與蛋白酶活性以及出血活性有關的金屬離子有Ca2+、Mg2+和Zn2+。Ca2+和Mg2+很容易經透析部分除去，對大部分蛇毒來說，失去部分Ca2+和Mg2+對出血活性影響不大，而對蛋白酶的活性有較大的影響。Zn2+很不容易透析出去，這說明它和蛋白質結合較牢固。以後的研究也表明絕大多數出血毒素都含有Zn，而且結合得較牢固。對從尖吻竣蛇毒中分離的出血毒素，Ac-Proteinase的Zn2+含量進行了分析，其結果與從蛇毒中分離的出血毒素HT-e相似，每個出血毒素的分子都含有i個zn2+，如果Zn2+被除去，兩種毒素的出血活性和蛋白水解酶活性都消失。Nikai還比較了當時發現的所有具有蛋白水解酶活性的出血毒素，結果發現，不管何種蛇毒，也不管蛇分佈在何種區域，其出血毒素中都含有Zn2+。當Zn2+被除去後，拉曼光譜的低頻部分發生較大的改變，這說明Zn2+對出血毒素的作用關係極大。除去Zn2+還會引起出血毒素螺旋結構含量降低，自由鬆散結構含量新增和鬆散結構新增。Zn2+的遺失可能和出血毒素失去生物活性有關。從蛇毒中分離出來的出血毒素a、b、C、d、e和f都含有1個Zn2+，用EDTA和1，10-菲咯啉處理後，它們的出血活性都消失，用1,10-菲咯啉除去出血毒素e中的Zn2+，它的出血活性和蛋白水解酶活性消失，如再加Zn2+，則活性又恢復。未除去Zn2+前，對出血毒素e的C.D譜進行分析，發現二級結構中有23%的a-螺旋結構、6%的卩-折疊結構和H%的鬆散結構，當90%的鋅離子被除去後，螺旋結構的含量下降到7%，而鬆散結構則新增了。由於Zn2+的除去還引起紫外吸收光譜的變化，這些變化與芳香胺基酸有關，Bjamason等人還認為Zn2+可能在分子中與Tyr的苯酸基結合。從蛇毒中分離出來的出血毒素Ac-Proteinase除去Zn2+也有與出血毒素e相似的結構變化。有些出血毒素除分子中含有Zn2+夕蔔，還含有Ca2+，例如從蛇毒中分離出來的出血毒素MucrotoxinA就含有2個Zn2+和3個Ca2+.Zhang等（1984）對從蛇毒中分離出來的出血毒素I所含離子進行了研究，發現每個毒素分子含有一個Zn2+和二個Ca2+。它的活性可以被Ca2+加强，能被Zn2+輕度抑制。當用EDTA處理時，它的活性徹底消失。如對1，10-菲咯啉透析，其中50%〜80%的金屬離子被除，出血毒素I的活性也降低50%〜80%。如果上述透析液中含5mmolCa2+，那麼毒素的活性有90%保留，這說明Ca2+對出血毒素I的出血作用是十分重要的。C.D譜分析也說明Ca2+在穩定出血毒素I結構方面起重要作用，至於Zn2+的作用現在還不清楚，更不知道加Zn2+為什麼能輕度抑制出血毒素I的活性。
出血毒素所含的金屬離子多為Zn2+和Ca2+。有些學者認為Zn2+在維持出血毒素的酶活性及生物活性方面起重要作用。也有的學者發現Ca2+對從蛇毒中分離出來的Proteinaseb有穩定作用，Zhang等的研究和Oshima的實驗結果相似。一般地說大部分出血毒素的活性依賴於Zn2+的存在，有些出血毒素則需要Ca2+。
Shutzman等（1980）報導EDTA不能除去金屬蛋白中的Zn2+，Zhang等也發現在5mmol/L濃度條件下EDTA也不能除去AaHI中的Zn2+，但如用0.lmol/L的EDTA究較多，其目的是從分子水准上弄清各種出血毒素的抗原性之間的關係，為研製廣譜抗出血毒素血清打下基礎。人們對不同蛇毒組分抗原性關係的研究有很長的歷史，已經積累了豐富的資料，過去人們多用粗毒和粗毒抗血清為資料研究不同亞種、不同種、不同屬以及不同科蛇毒抗原性之間的關係。研究結果顯示，親緣關係越近，免疫交叉反應越强，抗原關係越密切。隨著對蛇毒各組分的不斷分離，人們逐漸開始對蛇毒某種組分在不同蛇毒中的抗原關係進行研究。最初多對不同來源的突觸後神經毒素之間的抗原關係進行研究，以後開始對不同來源的膜毒素、PLA2以及神經生長因數各自的抗原關係進行研究。神經毒素、膜毒素和PLA2分子量都比較小，一級結構分析較容易。通過對一級結構比較，很容易發現它們的同源性。而對於神經生長因數和出血毒素，由於分子量比較大，有些還含有碳水化合物，所以對它們一級結構分析很困難，要想瞭解它們之間結構的關係，用抗原抗體反應顯得十分重要，在某些情况下可稱為惟一的方法。幸運的是，這些年在這方面的研究取得了很大的進展，下麵作些介紹。
早先Mandelbaum（l976）從美洲矛頭蝮蛇毒中分離出一種出血毒素HF2，Assakura等（1986）又從該毒中分離純化出兩種出血毒素HFi和HF3，並同時對3種出血毒素的免疫特性進行了研究。研究結果發現，儘管這3種出血毒素的理化特性以及生理活性有差別，但它們在免疫特性上相似，這說明它們的抗原性相似。Mandel-baum等（1988）比較了3種問屬於矛頭竣類和蛇毒中金屬蛋白（包括出血毒素和蛋白酶）的免疫特性，發現不同出血毒素之間抗原性相似，而不同非出血毒素蛋白酶之間抗原性相差很大。Mandelbaum等（1989）還對響尾蛇毒和蝰蛇毒出血因數的免疫特性進行了比較。他們用抗HFi、抗HF2、抗和抗NHFa、抗NHFb（來自的家兔血清測定其他粗毒中出血毒素的免疫特性。結果發現矛頭蝮類蛇毒出血毒素和響尾蛇各亞屬蛇毒出血毒素抗原性相似，但類蛇毒之間的同源性更大。巨蝮類蛇毒、北美類蛇毒、亞洲蝰蛇類和蝮蛇類蛇毒的出血毒素和類出血毒素之間也有一定的相似性。蜂蛇中的噝蝰屬（所汾）和蝰屬類蛇毒的出血毒素能部分地被抗血清中和。Martinez等（1989）比較了蛇毒中幾種出血毒素之間的抗原性以及其他響尾蛇毒出血毒素的抗原性。他們把r蛇毒中的兩種出血毒素通過免疫方法制出單克隆抗躰，然後用ELISA方法測定蛇毒中幾種出血毒素之間的免疫活性以及其他響尾蛇粗毒中出血毒素之間的免疫活性。其他這些響尾蛇包括：C.
scutatus^Crotalusv-lutosus^Crotalusv.oreganussCrotalushorridushorridus^C.molossus.結果表明，不但aimr蛇毒中幾種出血毒素之間抗原性十分相似，而且和其他響尾蛇出血毒素的抗原性也相似。總的來說，雖然出血毒素之間確切的同源性還不知道，但它們肯定在結構上有某種相似性，這種相似的結構可能和它們引起出血的活性位點有關。