隨著低劑量電子電腦斷層掃描（Low-dose Computed Tomography，LDCT）科技在肺癌篩查中的普及，肺結節的檢出比例大幅度提高[1]。依據在CT下能否完全遮蓋肺實質可將肺結節分為實性和亞實性兩類，而亞實性結節（Subsolid Nodule，SSN）又可根據有無實性成分進一步分為磨玻璃結節和部分實性結節兩類。SSN是一種影像學上的非特异表現，惡性SSN病理特徵可能是浸潤前或者浸潤性肺腺癌（Lung Adenocarcinoma，LUAD）。現時的臨床共識認為，影像學表現為SSN的肺腺癌是一種相對惰性的特殊亞型，具有非常好的預後[2]。腫瘤微環境（Tumor Microenvironment，TME）是一個包含多種細胞類型的複雜“生態系統”，TME的組成特點對腫瘤生物學特性的塑造至關重要，囙此全面詳細地刻畫SSN的TME有助於理解其特點，也可能為研究肺腺癌發生發展和浸潤轉移提供新的思路。
論文截圖
針對這一問題，北京大學人民醫院胸外科主任王俊院士團隊與北京大學生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創新中心（ICG）、生命科學學院白凡研究員團隊開展合作研究，應用單細胞轉錄組測序科技，全面揭示了影像學表現為SSN的肺腺癌腫瘤微環境特徵，為SSN相對惰性的生物學特性和較好的臨床預後特點提供了單細胞尺度上的解釋。相關成果以“Decoding the multicellular ecosystem of lungadenocarcinoma manifested as pulmonarysubsolid nodules by single-cell RNA sequencing”為題，於2021年1月27日以Research Article的形式線上發表於國際期刊Science Advances。
研究團隊對16名CT影像學表現為SSN的肺腺癌患者的手術切除樣本進行單細胞轉錄組測序，同時綜合了已經發表的六例癌旁樣本（nLung）和九例進展性肺腺癌樣本（mLUAD）數據，通過典型相關分析（CCA）算灋無偏地綜合了nLung、SSN和mLUAD樣本，共獲得118293個高品質單細胞數據（圖1A）。降維聚類鑒定出10種主要的細胞類型，包括EPCAM+上皮細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、漿細胞、髓系細胞、自然殺傷細胞（NK）、肥大細胞、成纖維細胞、內皮細胞和血紅細胞（圖1B-1C）。通過分析CD45+的免疫細胞相對比例，他們發現在SSN中，肥大細胞顯著富集；T細胞比例介於nLung與mLUAD之間；髓系細胞相比nLung顯著减少，相反的B細胞和漿細胞在SSN中顯著富集，這與mLUAD類似；NK細胞在SSN中的比例接近nLung，明顯多於mLUAD（圖1D-1E）。以上結果說明，相比nLung與mLUAD，SSN的TME在細胞組成上已呈現出不同的模式。
圖1.研究流程示意圖與SSN腫瘤微環境全景圖
通過單細胞轉錄組推斷拷貝數變異識別出的腫瘤細胞呈現出明顯的腫瘤樣本間異質性（圖2A-2B）。相比於SSN，mLUAD腫瘤細胞明顯上調細胞增殖、干擾素響應、PI3K-AKT和乏氧等相關通路。相比於正常上皮，SSN腫瘤細胞除了上調細胞增殖相關的通路外，還明顯上調很多代謝相關的通路，包括葡萄糖代謝、脂肪酸代謝和氧化磷酸化等（圖2C）。研究人員通過計算代謝通路活性發現，SSN腫瘤細胞呈現獨特的代謝模式（圖2D）。腫瘤樣本內異質性分析發現，mLUAD中存在細胞週期、線粒體訊號、上皮分化、上皮間質轉化和乏氧的功能模組。在SSN中，研究人員識別出一個强烈的免疫應激功能模組（圖2E）。以上結果表明，相比於mLUAD，SSN中的腫瘤細胞惡性程度相對較低，呈現出明顯的代謝紊亂和强烈的免疫反應應激狀態。
圖2.腫瘤細胞的識別與狀態比較
研究人員分析了SSN腫瘤免疫微環境中的各種細胞。在T/NK細胞方面，他們鑒定出五種CD4+T細胞、五種CD8+T細胞和兩種NK細胞亞型（圖3A）。SSN中效應CD4+T、耗竭CD4+T和調節性CD4+T細胞比例均處在nLung和mLUAD中間（圖3B）。SSN的CD8+T細胞整體組成更接近nLung，與mLUAD差別很大，表現為富集殺傷性很强的效應CD8+T，缺乏兩群與LUAD患者生存顯著相關的耗竭CD8+T細胞（圖3B-3D）。通過計算“殺傷耗竭比”，他們發現SSN的殺傷耗竭比值介於nLung和mLUAD中間（圖3E）。有趣的是，研究發現相比於mLUAD，SSN中顯著地富集CD16+NK細胞亞群（圖3B）。以上結果均說明，SSN中T/NK細胞免疫功能整體處於免疫監視殺傷而非耗竭狀態。
圖3.T/NK細胞亞群比例變化與狀態比較
髓系細胞亞群在三種不同狀態下組成差异比較大，反映了髓系細胞在不同TME的複雜性和多樣性（圖4A-4B）。SSN中顯著富集不同的DCs亞類，這些DCs表達不同的共刺激分子，並且SSN中DCs低表達促進CD4+T細胞向免疫抑制性調節T細胞分化的重要基因IDO1（圖4C）。研究特別發現了一群只在mLUAD中富集並高表達VEGFA、CCL2、SLC2A3、ADM等乏氧誘導基因的腫瘤相關巨噬細胞——Macro-C7（圖4D）。生存分析顯示，這群細胞與LUAD患者的預後顯著相關（圖4E）。標誌基因比較發現，Macro-C7與結直腸癌中報導的一群促進血管生成和EMT的巨噬細胞高度相似[3]，提示其在LUAD的浸潤轉移中可能的作用。
圖4.髓系細胞亞群的鑒定與特徵刻畫
這項研究對成纖維細胞和內皮細胞兩種基質細胞進行了詳細刻畫，共識別出六群內皮細胞和五群成纖維細胞（圖5A-5D）。有趣的是，SSN兩種基質細胞的組成呈現兩種完全相反的情况。內皮細胞的組成比例已經與mLUAD十分相似，表現為血管生成相關的Endo-C3增多，淋巴細胞歸巢相關的Endo-C5减少（圖5B）。而SSN成纖維細胞的組成比例仍然與nLung基本一致，但與mLUAD完全不同，缺少腫瘤相關成纖維Fibro-C3和周細胞Fibro-C5（圖5D）。特別地是，研究人員發現SSN中富集一群與免疫相關的成纖維細胞Fibro-C4，提示SSN中成纖維細胞可能存在免疫調節作用。以上結果說明，內皮細胞可能在LUAD早期階段就扮演非常重要的作用。
圖5.TME中基質細胞的識別與比較
研究人員通過“受體-配體”分析推測細胞類型之間的相互作用。相比於nLung，SSN和mLUAD中內皮細胞和巨噬細胞的“輸出事件”明顯增多，提示這兩種細胞在癌症進展中的促進作用。比較發現，SSN中NK細胞的整體互作事件明顯多於nLung和mLUAD，這與NK細胞在SSN中富集結果一致，提示NK細胞在SSN免疫微環境中的重要作用。進一步資料分析和實驗驗證結果顯示，SSN中富集的NK細胞可能是內皮細胞招募的。
圖6.細胞-細胞間相互作用的特點
該研究基於高通量單細胞轉錄組測序數據，詳細刻畫了SSN的TME中腫瘤細胞、免疫細胞、基質細胞的細胞類型、組成特點、轉錄組狀態和細胞間互作等特徵。特別的是，研究人員通過將SSN與nLung比較，揭示了SSN惡性發生發展的特點，並通過與mLUAD比較，在單細胞尺度上解釋了為何SSN具有相對惰性的生物學特徵和較好的臨床預後特點，對SSN和肺腺癌相關的分子基礎研究、臨床治療和藥物研發等具有重要意義和價值。
王俊、北京大學人民醫院胸外科邱滿堂助理研究員和白凡為本文的共同通訊作者。清華大學生命科學學院、北京大學-清華大學-北京生命科學研究所聯合項目博士研究生邢旭東和北京大學人民醫院胸外科楊帆教授為本文的共同第一作者。
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