作為神經系統資訊交流的“通貨”，神經電活動是大腦處理複雜資訊的物理基礎。與膜片鉗和微電極陣列記錄等基於電極資料的傳統電生理科技相比，螢光膜電位成像在時空分辯率、量測通量等方面具有明顯的優勢。其中，發射波長在遠紅區（640 nm以上）的螢光探針由於其紅移的光譜具有更强組織穿透能力，而且可適於多通路成像觀測，因而備受研究人員青睞。然而現時可使用的遠紅區膜電位探針在亮度和靈敏度方面存在嚴重缺陷，囙此亟需發展適用於記錄神經元動作電位的高性能螢光探針。
2021年4月15日，北京大學化學與分子工程學院鄒鵬課題組與陳鵬課題組共同在Nature Chemistry雜誌線上發表了他們最新的研究成果“A far-red hybrid voltage indicator enabled by bioorthogonal engineering of rhodopsin on live neurons”。他們綜合利用生物正交反應和膜蛋白工程化改造策略，開發出一系列具有高靈敏度和成像信噪比的螢光膜電位探針HVI（hybrid voltage indicator）。根據成像光譜需求，HVI的蛋白質骨架可借助生物正交反應搭配不同化學結構的螢光染料，構建出一系列跨越可見光譜的複合型探針。其中，橙紅區探針HVI-Cy3具有最高的靈敏度，能够以高達90的信噪比成像記錄神經動作電位；遠紅區探針HVI-Cy5具有最紅移的光譜，不僅可與綠色或紅色螢光探針同時使用，實現膜電位與鈣離子、神經遞質等重要生理訊號的並行觀測，還能够與光遺傳學工具聯用，實現全光學神經電生理檢測。
圖1.複合型膜電位探針HVI檢測神經元膜電位概念圖
鄒鵬課題組長期致力於發展和應用化學探針科技，研究參與神經信號轉導過程的生物大分子、支配神經活動的化學和物理訊號。他們率先提出“複合型膜電位探針”的概念，利用化學手段將螢光染料與視紫紅質蛋白相偶聯，利用後者的電致變色效應實現膜電位成像（Angew. Chem. Int. Ed. 2018，57，3949-3953）。陳鵬課題組長期致力於發展適用於活細胞及活體動物的生物正交反應，並通過遺傳編碼科技，實現了蛋白質的特异標記、啟動與調控（Nat. Chem. Biol. 2016,12129-137）。在最新的研究成果中，兩個課題組合作，將化學反應策略與蛋白質骨架改造相結合，對神經元的膜蛋白進行了原位的“生物正交”工程優化。一方面，鑒於現時大多數生物正交反應難以高效地標記膜蛋白，以及點擊化學反應（銅催化炔基-疊氮環加成反應）對神經元的毒性，他們改用了生物相容性更好、效率更高的逆電子需求狄爾斯-阿爾德反應（IEDDA），將高熒光量子產率的遠紅區染料引入工程改造的視紫紅質蛋白的特异位點。另一方面，他們針對視紫紅質蛋白Ace2中的關鍵質子受體胺基酸殘基進行突變篩選，最終得到了消除穩態光電流且亮度及靈敏度顯著提升的遠紅區複合型探針HVI-Cy5。當神經元膜電勢發生去極化時，質子電化學勢的改變促進視黃醛席夫堿的質子化，從而改變視紫紅質的吸收光譜，最終通過FRET效應影響其偶聯螢光染料的量子產率，導致螢光訊號變化（圖2）。
圖2.複合型膜電位探針HVI螢光標記方法示意圖及探針響應細胞膜電位變化原理圖
實驗表明，HVI-Cy5可與光遺傳學工具聯用（圖3）。研究人員用短波長光單向或者雙向調控神經元興奮性，同時在遠紅區螢光通道記錄膜電位變化，擴充了全光學電生理學工具箱（圖3a-c）。該科技相比於傳統的多電極膜片鉗刺激並記錄，科技難度明顯下降。HVI-Cy5還可以與其他螢光探針進行雙色成像，無串擾監測細胞膜電勢及鈣離子、遞質和pH等生理訊號（圖3d-f）。多色成像將幫助研究者更好地瞭解膜電位與其他生理訊號動態變化的聯系和差异。
圖3.具有深紅螢光光譜的HVI-Cy5可與光遺傳學工具及鈣探針聯用實現全光學電生理檢測
此外，實驗將HVI-Cy5與光遺傳學工具分別表達在不同的大鼠海馬體神經元中，利用膜電位成像評估APV和NBQX兩種藥物對神經元突觸連接的影響，解析了NMDAR和AMPAR兩類谷氨酸受體對突觸訊號傳遞的貢獻（圖4）。未來，HVI-Cy5有望用於在體外篩選作用於受體蛋白的激動劑或拮抗劑。
圖4.將HVI-Cy5與光遺傳學工具分別表達在不同神經元中可以研究藥物對神經突觸的作用
總之，本文通過對視紫紅質膜蛋白的“生物正交”工程優化，發展了適用於神經元電信號記錄的遠紅區高性能螢光探針HVI-Cy5，實現多色成像和全光學電生理學應用，期待該探針能够幫助研究者解讀更加複雜的神經元電生理訊號。
北京大學化學與分子工程學院博士研究生劉書彰、林暢，北大-清華生命聯合中心博士畢業生胥永顯（現浙江大學醫學中心博士後）為該論文的共同第一作者。鄒鵬研究員和陳鵬教授為該論文的共同通訊作者。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部、生物有機與分子工程教育部重點實驗室、北京分子科學國家研究中心和北大-清華生命科學聯合中心的資助。
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