來源：iNature（ID:Plant_ihuman）
新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）導致COVID-19全球大流行給人類的健康與生活帶來了嚴峻挑戰。儘管COVID-19整體死亡率約為2%，但是根據中國疾病預防控制中心和義大利疫情重災區倫巴第地區的流行病學分析顯示，重症患者的死亡率高達49%1,2。同時重症COVID-19患者的屍檢結果發現：重症患者肺部可見大量補體成分（C3，C4，C5，MASP-2）沉積3,4，引起肺泡膜損傷、毛細血管通透性新增和微血栓形成；並可造成肺泡上皮損傷、表面活性物質减少或消失、加重肺水腫和肺不張，最終導致急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。多個臨床實驗資料表明：抑制補體的過度啟動將有助於改善重症患者的臨床預後5-8。有文獻指出，SARS-CoV-2核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白能够通過MASP-2啟動補體系統加劇COVID-19患者的肺部損傷9。儘管現時針對該疾病重症化進展的研究較多，但靶向病毒N蛋白的大分子特异性藥物研發及N蛋白介導補體异常啟動的快速分析系統等方面的研究較少。
2021年5月11日，中山大學附屬第五醫院陳守登教授課題組，單鴻教授課題組，肖非教授課題組及暨南大學廖化新教授組成的合作團隊在Nature Communications線上發表題為“A SARS-CoV-2 antibody curbs viralnucleocapsid protein-induced complement hyperactivation”的研究論文，該研究利用基於臨床康復者血液樣本的全人源抗體篩選方法，從中山大學附屬第五醫院治癒出院的COVID-19恢復期患者血液中分離出人源性SARS-CoV-2 N蛋白抗體，並通過抗原抗體複合物晶體結構解析，分析抗原錶比特及構象變化特點。此外，團隊自主開發了離體、無病毒的補體過度啟動檢測系統，篩選出了能够有效抑制N蛋白引起的補體過度啟動的全人源化的特异性抗體。
圖1：研究工作論文首頁
研究人員首先對COVID-19不同時間段（7-25天）的恢復期病人血清進行篩選，發現針對N蛋白的抗體滴度普遍高於S蛋白抗體滴度，恢復期早期（9天）的患者N蛋白抗體的滴度更高。後續研究中，研究人員從中選擇了抗體滴度最高的患者（恢復期9天）血液進行PBMC的分離，進一步通過流式細胞術分離出針對N和S蛋白特异性的記憶B細胞和漿細胞。研究人員通過測序鑒定了S蛋白的5種漿細胞抗體和3種記憶B細胞抗體；N蛋白的20種漿細胞的抗體和12種記憶B細胞的抗體。從抗體的突變長度和突變胺基酸的數目來看，研究人員發現針對N蛋白抗體的成熟度要高於S蛋白【圖2】。
圖2：抗體的篩選及其特點
此外，研究人員通過初步的抗原錶比特鑒定（NTD、CTD、N-FL），和抗原抗體親和力的測定，篩選出了結合N蛋白全長和與抗原親和力最强的抗體nCoV396（KD=1.02 nM）【圖3】。
圖3:N蛋白抗體抗體對抗原的反應性和親和力
緊接著，研究人員利用X線繞射的方法解析了N-NTD（49-173aa）和nCoV396Fab複合物高解析度的晶體結構（PDB:7CR5）。結果顯示，抗體利用其輕鏈CDR1、CDR3和重鏈CDR1、CDR2、CDR3，通過親水和疏水相互作用識別N-NTD的C端（159-163aa）區域。NTD與抗體結合的Q163，L167和K169位點在冠狀病毒中相對保守，提示該抗體可以結合其他高致病性冠狀病毒的N蛋白，具有潜在廣譜的應用前景。SPR分析也證實nCoV396Fab同樣可以和SARS（KD=7.26nM）和MERSN蛋白結合（KD=12.6nM）。通過進一步與NTD單體（PDB:6M3M）的結構比對，研究人員發現，N蛋白結合抗體之後，NTD的C端有大約80º遠離手掌區的擺動，以暴露出抗原錶比特，這可能導致N蛋白的NTD和CTD相對位置的變化。同時，NTD的手指區域從RNA結合區域向外移動了7.4Å，導致了N蛋白結合RNA口袋的擴大，提示nCoV396可能影響了N蛋白結合RNA的能力【圖4】。
圖4: mAb nCoV396和SARS-CoV-2 N-NTD複合物結構
為了進一步驗證N蛋白抗體nCoV39的功能，研究人員自主開發了一種離體檢測補體過度啟動狀態的方法。通過利用自身免疫性疾病且C3或者C4升高的病人血清，加入MASP-2特异性螢光淬滅底物（2Abz-SLGRKIQI-Lys（Dnp）-NH2），用酶標儀檢測初始反應速率（V0），計算最大反應速率（Vmax）和米氏常數（Km）以反映補體啟動狀況。當體系中加入了SARS-CoV-2 N-FL後，隨著N-FL濃度的新增，Vmax也隨之新增，說明補體系統被SARS-CoV-2 N蛋白啟動。令人滿意的是，當體系中加入過量的nCoV396Fab，補體的啟動會被抑制，其抑制補體效果與抗體的濃度呈正相關【圖5】。該實驗結果在多例不同補體啟動的患者血液中得以重複。
圖5: mAb nCoV396抑制SARS-CoV-2 N蛋白誘導的補體過度啟動
總的來說，該研究分離出了首個全人源的SARS-CoV-2 N蛋白的抗體，確定了該抗體識別N蛋白的抗原錶比特，通過離體的補體啟動實驗，確定了N蛋白在補體過度啟動中的作用，同時鑒定了nCoV396能够抑制N蛋白誘導的補體過度啟動的功能。為補體過度啟動的重症COVID-19患者提供了新的候選治療方案的理論基礎。
中山大學附屬第五醫院博士後康斯斯，博士研究生楊梅、何素華，暨南大學王月明為文章的共同第一作者。中山大學附屬第五醫院陳守登教授，單鴻教授，肖非教授及暨南大學生命科學技術學院廖化新教授為論文的共同通訊作者。該項工作得到了珠海市新型冠狀病毒疫情防控應急研究（社會發展類）專項基金的支持。同時感謝上海同步輻射光源工作人員BL18U/19U/17U對X線繞射數據篩選和收集工作的幫助的支持。
Reference:
1.The epidemiological characteristics ofan outbreak of 2019 novel coronavirus diseases（COVID-19）in China.Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi41，145-151，doi:10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2020.02.003（2020）.
2.Grasselli，G.et al.Risk Factors Associated With Mortality Among Patients With COVID-19 inIntensive Care Units in Lombardy，Italy.JAMAInternal Medicine，doi:10.1001/jamainternmed.2020.3539（2020）.
3.Magro，C.et al.Complement associated microvascular injury and thrombosis in the pathogenesis of severe COVID-19 infection: A report of five cases.Translational research：the journal of laboratory and clinicalmedicine220，1-13，doi:10.1016/j.trsl.2020.04.007（2020）.
4.Diao，B.et al.Human Kidney is a Target for Novel Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2（SARS-CoV-2）Infection.medRxiv，2020.2003.2004.20031120，doi:10.1101/2020.03.04.20031120（2020）.
5.Kulasekararaj，A. G.et al.Terminal complement inhibition dampens the inflammation during COVID-19.British journal of haematology190，e141-e143，doi:10.1111/bjh.16916（2020）.
6.Mastaglio，S.et al.The first case of COVID-19 treated with the complement C3 inhibitor AMY-101.Clinical immunology（Orlando，Fla.）215，108450-108450，doi:10.1016/j.clim.2020.108450（2020）.
7.Laurence，J.et al.Anti-complement C5 therapy with eculizumab in three cases of critical COVID-19.Clinical immunology（Orlando，Fla.）219，108555-108555，doi:10.1016/j.clim.2020.108555（2020）.
8.Rambaldi，A.et al.Endothelial injury and thrombotic microangiopathy in COVID-19: Treatment with the lectin-pathway inhibitor narsoplimab.Immunobiology，152001，doi:10.1016/j.imbio.2020.152001（2020）.
9.Gao，T.et al.Highly pathogenic coronavirus N protein aggravates lung injury byMASP-2-mediated complement over-activation.medRxiv，2020.2003.2029.20041962，doi:10.1101/2020.03.29.20041962（2020）.
參考消息：
https://www.nature.com/articles/s41467-021-23036-9
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