近日，西湖大學徐和平課題組在Nature Immunology雜誌線上發表題為“Coupled analysis of transcriptome and BCR mutations reveals role of OXPHOS in affinity maturation”的研究成果。基於綜合分析抗體突變模式與轉錄組資訊並結合遺傳學實驗手段，揭示了氧化磷酸化（OXPHOS）通路在生髮中心（Germinal Center，GC）B細胞親和力正向篩選中的關鍵作用。
高親和力的中和型抗體是機體長效抵抗病原微生物感染的重要武器，是絕大多數疫苗發揮作用的基礎。抗體親和力成熟所必須的B細胞受體（B cell receptors，BCRs）可變區高頻突變與正向篩選發生在脾臟與淋巴結內部一個稱之為GC的組織結構區域。GC分為兩個功能不同的區域——暗區和明區。B細胞在不同區域間反復遷移，並通過達爾文式的演化過程實現對高親和力BCR突變的正向篩選，最終篩選出產生能够高親和力抗體的漿細胞。由於領域內一直缺乏有效的分子標記從一個多尅隆免疫反應中區分和富集出獲得高親和力突變的GC B細胞，當前具體哪些胞內分子通路在支持高親和力GC B細胞的正向篩選這一重要問題還未被系統性的研究。
基於經典的NP-KLH免疫小鼠模型，徐和平課題組創新性地在單細胞水准上將抗體突變模式與轉錄組表達水准進行關聯分析來突破這一研究難題（圖1）。NP-KLH是一種T細胞依賴性抗原，已知其在小鼠模型內誘匯出的生髮中心反應達到頂峰時，與半抗原NP特异性結合的GC B細胞主要表達抗體重鏈可變區基因片段VH186.2；此外，該基因編碼的胺基酸序列的第33比特色氨酸突變成亮氨酸後，BCR與NP的親和力提升至原來的10倍，而其他的隨機突變並不顯著性地改變親和力。以上兩個重要的免疫應答特性使得研究者們可根據BCR序列的突變情况來區分NP結合親和力的高低。在此基礎上，利用5’端單細胞轉錄組分析科技可同時獲得每個B細胞的BCR序列突變模式和轉錄組資訊，從而可對與親和力成熟相關聯的分子機制進行全面挖掘與分析。
圖1：綜合BCR突變資訊和轉錄組數據揭示抗體親和力成熟的關鍵分子機制
基於轉錄組數據和已知的基因表達特徵，作者們首先確認了不同類群GC B細胞所處的空間區域和細胞週期等狀態。為了更加全面探索細胞基因模塊表達的變化，作者們引入了機器學習中的主題模型算灋。相較傳統的比較不同類群細胞間差异表達基因的方法，主題模型算灋除了能找到分群特异性基因特徵外，還能够發現跨分群的基因模塊，實現對細胞狀態更精細化的描繪。比如過去有研究認為生髮中心明區氧含量較低，從而認為GC B細胞只能够進行糖酵解。而本工作中的主題模型分析揭示和比較了不同區域GC B細胞的代謝特徵，發現明區細胞表達更高水准的糖酵解通路相關基因，相反，暗區細胞則表達更多的OXPHOS和脂肪酸氧化通路基因，表明不同區域GC B細胞具有不同的代謝活動（圖2）；這在一定程度上說明之前關於GC B細胞只進行糖酵解的結論是不正確的。在本研究準備投稿過程中，有新發表的工作通過體外檢測原代GC B細胞代謝活動也說明GC B細胞主要進行OXPHOS，而不是糖酵解。
圖2：不同區域GC B細胞表現出不同的代謝特徵（灰色背景的為暗區GC細胞）
更重要的是通過結合BCR突變模式資訊，作者們發現有高親和力突變（獲得W33L突變的VH186.2基因）的NP特异性GC B細胞相較低親和力群體具有更高的OXPHOS通路的基因表達，暗示了該通路可能在親和力成熟過程中發揮重要作用（圖3）。
圖3:NP特异性GC B細胞免疫應答中OXPHOS與VH186.2親和力呈正相關性
此外，在OVA蛋白抗原誘匯出的更複雜的多尅隆免疫應答模型中，作者們不僅進一步確認了OXPHOS與親和力正向篩選之間具有正相關性，也說明了本工作開發出的研究方法可用於解析更為複雜的B細胞免疫應答特徵（圖4）。
圖4:OVA特异性GC B細胞免疫應答中OXPHOS與VH186.2親和力呈正相關性
通過與匹茲堡大學Harinder Singh教授的合作，作者們通過遺傳學手段驗證體內OXPHOS通路在親和力正向篩選過程中的作用。Cox10基因編碼血紅素IX法尼基轉移酶，是線粒體電子傳遞鏈上細胞色素c氧化酶複合物的重要組成部分，其缺失後會導致OXPHOS活動受損。相較對照組小鼠，GC B細胞中Cox10缺陷小鼠的GC B細胞的比例，增殖以及抗體的親和力都顯著性地下降，證明GC B細胞依賴OXPHOS來實現親和力正向篩選（圖5）。
圖5:Cox10基因缺失抑制GC反應與抗體親和力成熟
最後，通過嘗試多種被報導能够促進OXPHOS活性的小分子，作者們發現一種名為oltipraz小分子能够在體內促進GC B細胞的正向篩選和抗體親和力成熟，這是現時第一個被報導具有類似功能的化學小分子（圖6）。
圖6：小分子oltipraz具有加速抗體親和力成熟的作用
本研究成果不僅證明了OXPHOS通過促進高親和力GC B細胞的快速分裂來促進正向篩選和親和力成熟，還為通過小分子干預抗體親和力成熟過程和疫苗設計提供了新的思路和靶點。此外，利用專案開發的分析方法與流程，本研究工作還成功分析出複雜抗原的BCR應答突變模式與分子通路表達的相關性，證明了該方法能够廣泛應用於解析諸如自身免疫、移植排异免疫等複雜疾病中BCRs多樣性與分子應答特徵。
西湖大學徐和平研究員和匹茲堡大學Harinder Singh教授為論文共同通訊作者，西湖大學博士研究生陳鈿雨、王琰和匹茲堡大學博士後Godhev K Manakkat Vijay為本文共同第一作者，此外科研助理富舒潔為項目的推進做出了重要的貢獻。本項目受到國家自然基金委、科技部重點研發計畫以及西湖教育基金會的資助；項目實施過程中得到了西湖大學實驗動物中心、流式平臺、基因組學平臺以及超算平臺的大力支持。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41590-021-00936-y
附徐和平課題組簡介與招聘資訊
西湖大學系統免疫學實驗室致力於探究調節體液免疫應答與黏膜炎症反應的關鍵分子機制與網絡。在有機綜合利用遺傳學動物模型、臨床樣本以及前沿生物資訊學的基礎上，著重研究免疫與神經系統等組織特异性微環境在炎症反應與抗體應答中的互作機制。近年來在Nature（2篇）、Nature Immunology（2篇）、Immunity（1篇）等主流雜誌上發表多篇學術論文。在國家海外高層次人才項目、國家自然基金委聯合基金重點專案以及科技部重點研發計畫等項目的支持下，實驗室各項課題進展順利，當前急需青年才俊加入團隊，共同成長和發展！實驗室有多個博士後、博士生與科研助理崗位，歡迎聯繫（xuheping@westlake.edu.cn）！
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