摘要
近日，《德國應用化學》（Angewandte Chemie International Edition）線上發表了山東大學微生物國家重點實驗室的吳長生教授和李越中教授課題組完成的研究工作“Myxadazoles，Myxobacterium-Derived Isoxazole-Benzimidazole Hybrids with Cardiovascular Activities”。該工作報導了一類具有心血管活性的天然的异惡唑-苯並咪唑先導化合物黏菌唑（myxadazole），揭示了其脂肪酸鏈是由一條非典型的PKS/NRPS基因簇所編碼，N-核糖醇基-5,6-二甲基苯並咪唑則來自維他命B12代謝途徑，推測該化學骨架由“碳-氮”交叉耦合形式構建而成。
內容
微生物天然產物是人類新藥發現的重要源泉，而人類對新穎活性先導化合物的需求一直是如饑似渴。儘管該領域的研究一度因為高度重複發現而陷入困境，但隨著微生物基因組測序的普遍，人們發現微生物中存在海量的沉默基因簇未被開發，新藥挖掘的潜力巨大。其中，黏細菌是公認的一類次生代謝產物豐富的微生物種群。然而，由於黏細菌生長慢、難培養、資源難以獲得等特點，我國對黏細菌天然產物的研究十分滯後。
吳長生、李越中教授課題組在黏細菌天然產物的挖掘過程中，從一株分離自西藏洞措湖沉積物的黏細菌Myxococcussp.SDU36中發現並鑒定出了一類新穎的黏菌唑結構。通過建立該菌株粗提取物的分子網絡，從中找到了少量的黏菌唑同系物。通過二級質譜離子碎片資訊，作者從其斷裂情况中推斷出結構變異均發生在异惡唑環和末端羧基之間（圖1），這為之後的生物合成推導提供了重要線索。
圖1.黏菌唑的質譜分子網絡分析
為了探究黏菌唑的生物合成機制，基於黏菌唑中含异惡唑脂肪酸片段的特點，作者以[1-13C]-乙酸鈉飼喂SDU36，證實黏菌唑結構裏的脂肪酸片段確實來自於PKS途徑。又由於該脂肪酸鏈异惡唑雜環的生成涉及氮原子的引入，作者利用AntiSmash對SDU36全基因組進行分析，鎖定了一條非典型的PKS/NRPS生物合成基因簇mdz。隨後對兩個覈心的PKS基因mdzE和mdzI進行插入失活，證明mdz確系參與了黏菌唑的生物合成。且mdzI失活後，依然能檢測到黏菌唑C和D（少了一次C2單元的延伸），從而確定了mdzE先於mdzI工作，且mdzA這一游離的TE結構域可獨立工作（圖2）。考慮黏菌唑中的5,6-二甲基苯並咪唑片段僅報導存在於維他命B12中，且發酵培養基的配方中也存在維他命B12，囙此作者推測維他命B12的代謝途徑也參與進了黏菌唑的生物合成。作者採用前體導向生物合成（Precusor-directed Biosynthesis）的方法，以維他命B12分別飼喂培養於CTT和VY/2兩種培養基中的SDU36，定量分析培養結束時粗提取物中的黏菌唑含量，發現飼喂了維他命B12後，黏菌唑的含量得到了顯著提升，可間接證明N-核糖醇基-5,6-二甲基苯並咪唑則來自維他命B12代謝途徑。作者推測這兩條完全不同的生物合成途徑是通過一個“碳-氮”交叉耦合而構建出黏菌唑的新奇化學骨架。儘管人們已經熟知微生物中普遍存在不同生物合成途徑的雜合，如聚酮-非核糖體多肽（PKS/NRPS）、聚酮-萜（PKS/terpene）等，黏菌唑的生物合成途徑中所涉及的雜化管道是前所未有的。可以想像，微生物中潜藏了更多未被人知的雜化途徑所造就的“未知的未知物（unknown unknowns）”。
圖2.黏菌唑的生物合成推導。（A）黏菌唑脂肪酸片段生物合成由非經典PKS/NRPS雜合生物合成基因簇mdz負責。MdzI蛋白中最後一個推定的TE結構域可能是無活性的。（B）推測的維他命B12生成N-核糖基-5,6-二甲基苯並咪唑的過程。推測孤兒生物合成基因簇rib中含有的ribG是催化核糖基開環轉化為核糖醇基的關鍵還原酶。（C）代表性產物黏菌唑A和C。
作者對分離出的黏菌唑A1/A2和B進行了抗菌、抗真菌、細胞毒、抗氧化和抗炎等活性測試，未觀察到顯著活性。心血管活性實驗結果證實：黏菌唑A1/A2和B（1–3）能明顯促進損斑馬魚的血管生成，在10µM和25µM劑量下可對PTK787誘導破壞掉的血管進行修復，其修復能力與丹紅注射液（陽性對照，9µL/mL）的修復能力相當；同時還證實：黏菌唑A1/A2和B在10µM和25µM濃度下也對血栓具有一定的緩解作用，治療效果分別為31.7%和59.0%（陽性對照組160µM阿司匹林的治療效果為71.1%）（圖3）。黏菌唑對斑馬魚心血管生成的促進作用和抗血栓作用十分可觀，有望促進新一代心血管系統藥物的開發和應用。
圖3.黏菌唑對斑馬魚的促血管生成作用和抗血栓作用
同時，作者在文章中最後指出，儘管當今基因組挖掘途徑已成為微生物天然產物領域的一種重要手段，然而該方法現時仍然難以駕馭微生物中“多條基因簇相互交流”的情况，仍需開發多樣化的有效工具，以最大限度挖掘微生物天然產物“暗物質”，造福人類！
導師
2011年受中國留學基金委建設高水准博士生專案資助，於荷蘭萊頓大學攻讀博士學位，從放線菌中尋找新型抗生素；2017年獲得荷蘭國家自然科學基金委優秀博士後專案資助赴美國洛克菲勒大學進行博士後進修，從事宏基因組學方法挖掘新型鈣依賴抗生素。2019年6月全職回國，加盟山東大學微生物科技國家重點實驗室，任教授、博導，致力於黏細菌天然產物的發現及其合成生物學改造。在J. Am.Chem.Soc.，Angew.Chem.Int. Ed.，Org.Lett.，J. Nat.Prod.等天然產物化學領域的權威期刊發表學術論文，授權國際專利1項。現時，吳長生教授與李越中教授團隊進行深度合作，綜合綜合核磁代謝組學、質譜代謝組學、基因組學三大工具的互補性優勢，對黏細菌資源庫中的菌株進行高通量篩選，實現的黏細菌來源的天然產物“暗物質”的高效挖掘；之後，對所發現的結構新穎、活性突出的先導化合物，通過分子生物學、酶化學等手段進行生物合成研究，指導合成生物學的結構改造，促進成藥。
招聘
吳長生教授課題組長期招聘天然產物化學、有機合成、分子生物學、生物化學、生物資訊學等相關領域的博士、博士後，急需有機合成背景的人才，有興趣的可以聯系wuchangsheng@sdu.edu.cn。
原文刊載於【遇見生物合成】公眾號
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