摘要
碳一化合物（C1）如二氧化碳的生物利用是碳中和和綠色生物製造的關鍵技術。CO2可通過先轉化為甲醇或甲醛進入生物合成，如通過醛縮酶的催化作用。這裡，我們介紹一種在大腸桿菌中使用脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶（DERA）將甲醛和乙醇轉化為綠色化學品1,3-丙二醇（PDO）的新型合成途徑，PDO是合成PTT塑膠的重要原料，生物合成方法多年來一直國外公司壟斷，是影響我國塑膠產業的“卡脖子”科技之一。DERA催化甲醛和由乙醇轉化而來的乙醛的縮合並形成3-羥基丙醛（3-HPA），並進一步還原形成PDO。與所有其他已知的PDO合成途徑（通常30-50%的碳作為二氧化碳和其他副產物損失）不同的是，這一新途徑為從C1化合物和C2化合物合成具有重要工業用途的C3化合物而無碳損失提供了可能性。
圖1 PDO新型生物合成途徑示意圖。
內容
在本實驗室（曾安平組）於2019年發表在ACS Synthetic Biology的研究中，醛縮酶曾被用來利用甲醛和丙酮酸生產PDO。在該反應中，我們注意到，丙酮酸的羧基並沒有直接參與該羥醛縮合反應過程，並且在後續的反應中該羧基被脫除了，實際上乙醛部分才是與甲醛形成C-C鍵的真正受體（如圖2）。囙此，我們推測存在某種醛縮酶，它可以直接催化甲醛和乙醛生成3-HPA，並進一步轉化為PDO。
圖2反應機理（丙酮酸的羧基並沒有直接參與縮合反應）（A）及新酶發掘思路（B）。ACALD:acetaldehyde。
經過兩輪對醛縮酶的篩選，我們得到了來源於海棲熱袍菌的脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶（DERATMA），與丙二醇脫氫酶共表達可以較為高效地實現體內甲醛和乙醛向PDO的轉化，並且分別利用13C標記的甲醛和乙醛進行驗證從而明確所得PDO完全來源於被該酶轉化的甲醛和乙醛（如圖3）。通過過表達乙醇脫氫酶構建乙醛供應模塊，並敲除了frmA基因，在以甲醛和乙醇為底物時，PDO的產量達到0.97 g/L。我們也通過過表達甲醇脫氫酶構建甲醛供應模塊，但由於甲醇脫氫酶活力的限制，以甲醇和乙醇為底物，在42 h時PDO產量僅達到0.08 g/L。
圖3利用GC-MS和13C標記的甲醛和乙醛驗證PDO的合成。
已有文獻報導DERA具有催化乙醛自縮合的能力，在上述轉化過程中，我們也同樣發現了一些二醇類副產物的生成。我們利用13C標記的乙醇對這些二醇類副產物進行鑒定，推斷其形成路徑如圖4。
圖4推斷的二醇類副產物合成圖。
有趣的是，我們發現通過維持一定的甲醛濃度（在本實驗中為0.6 mM）可以有效地避免這些二醇類副產物的產生。囙此，我們在轉化過程中多次補加甲醛以簡單地維持其濃度，使得PDO產量提高至1.32 g/L，並且沒有二醇類副產物的產生，這對利用該途徑產PDO具有很重要的意義（圖5）。
圖5以甲醛和乙醇為底物的補料批次轉化用於生產PDO。
總結
在這項工作中，通過使用乙醛作為新型生物催化反應中的甲醛受體，豐富了C1化合物的應用。並且我們在利用該反應進行PDO生產時詳細說明了三個代謝模塊：基於DERA的PDO生產模塊，乙醛供應模塊和甲醛供應模塊。從理論上講，這一新途徑為從C1和C2化合物在沒有碳損失的情况下（即碳收率100%）合成具有廣泛工業用途的C3化合物提供了可能性。
應該指出的是，現時使用的酶DERATMA對甲醛的親和力（Km= 2.54±0.07 mM）和活性（1.27±0.02 U/mg）仍然非常有限，對該酶的蛋白質工程和宿主菌株的系統代謝工程工作對於將C1化合物直接用於合成生物學中增值產品生產應具有非常重要的意義。此外，維持一定水准的細胞內甲醛對於避免乙醛的自聚合和其他二醇副產物的形成是重要的。值得一提的是，該途徑的三個反應都是可逆的，儘管估計甲醛和乙醛縮合反應的標準吉布斯自由能為負（-3.702 kJ / mol），該反應在熱力學上是有利的，但在進一步考慮時，驅動力或路徑平衡可能是一個關鍵問題。北京化工大學軟物質高精尖中心碩士研究生孟豪為本文的第一作者，德國漢堡工業大學曾安平教授以及農科院植保所任傑助理研究員為本文的共同通訊作者。原文刊載於【遇見生物合成】公眾號
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