工業絲狀真菌土麯黴合成生物技術研究進展及展望

絲狀真菌作為一類重要的微生物,在食品、醫藥、化工等國計民生領域發揮了重要作用,其合成生物技術的發展已經展示了更大的工業應用潜力。挖掘土麯黴底盤細胞在合成生物學研究中的優勢,可以更好地拓展合成生物技術的應用。

絲狀真菌作為一類重要的微生物,在食品、醫藥、化工等國計民生領域發揮了重要作用,其合成生物技術的發展已經展示了更大的工業應用潜力。土麯黴是一種非常具有工業生產價值的絲狀真菌,是生物基化學品衣康酸和降血脂藥物洛伐他汀的工業生產菌,展現出了强大的天然產物合成能力和突出的工業發酵效能,具有成為典型性絲狀真菌底盤細胞應用於合成生物技術開發的價值。近年來,在土麯黴工業菌株改造與發酵工藝優化、生物合成機制解析等方面都開展了系列的研究,顯著推動了其合成生物技術研究的發展。本文綜述了土麯黴合成生物技術工具開發、衣康酸和洛伐他汀工業生產菌株改造優化、次級代謝產物生物合成機制解析等方面的最新研究進展,並對土麯黴的合成生物技術應用前景和發展方向進行了展望。挖掘土麯黴底盤細胞在合成生物學研究中的優勢,可以更好地拓展合成生物技術的應用。

自然界微生物豐富的種質資源、代謝途徑及其調控機制的多樣性,結合合成生物學使能科技的快速發展,構成了從研發優質微生物底盤細胞到高效微生物細胞工廠及終端目標產品的微生物合成生物科技領域。絲狀真菌作為一類重要的微生物,在食品、醫藥、化工等國計民生的領域發揮了重要的作用,而絲狀真菌合成生物技術的發展已經展示了更大的工業應用潜力。

土麯黴是一種環境中常見的絲狀真菌,具有土褐色緻密直柱形分生孢子頭、密集的產孢細胞和很小的分生孢子(圖1),它的無性孢子(分生孢子)的萌發溫度範圍較寬(11~48℃),而且能够耐受高滲透壓,可以廣泛分佈於各種生境中。像其他麯黴一樣,土曲黴最初也被認為是嚴格的無性生殖,通過產生無性孢子進行傳播繁殖,直到2013年才首次觀察到它可以進行有性繁殖。由於土麯黴並非傳統食品發酵使用真菌,所以不如米麯黴、黑麯黴和紅麯黴等食品安全使用微生物那樣為福斯所知。但事實上,土麯黴已經在生物化工和醫藥領域展現出了非常大的應用價值,是生物基化學品衣康酸和降血脂藥物洛伐他汀的工業生產菌,其產品年銷售額高達幾十億美元。成功的生產應用也證明土麯黴在初級代謝產物和次級代謝產物合成方面都具有很强的能力,並展現出了非常突出的工業發酵效能,具有成為典型性絲狀真菌底盤細胞應用於合成生物技術開發的價值。近年來,土麯黴在工業菌株改造與發酵工藝優化、生物合成機制解析等方面都引起了國內外學者的關注,使其合成生物技術研究方面取得顯著進步。本文將對土麯黴的上述研究進展進行系統介紹,並對土麯黴合成生物技術研究的未來發展進行討論。

圖1土麯黴的各種形態

1土麯黴合成生物技術工具開發

與大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物相比,絲狀真菌遺傳改造科技仍不够系統且相對低效,可供選擇的篩選標記、啟動子和終止子等遺傳改造元件也比較有限。現時只有少數常用的篩選標記被證實在土麯黴中可用,如潮黴素抗性基因hph、吡啶硫氨素抗性基因ptrA、博來黴素抗性基因ble和基於尿嘧啶營養缺陷型的篩選標記pyrG,還有一些在其他絲狀真菌中有效的篩選標記仍有待驗證。

(1)啟動子構巢麯黴的PgpdA啟動子是研究較多的啟動子,在絲狀真菌中應用廣泛,土麯黴最初遺傳改造也是使用PgpdA啟動子驅動目的基因表達。此外,構巢麯黴PtrpC、PadhA和紅麯黴Pmgpd等异源啟動子也有被應用於土麯黴遺傳改造中。Tet誘導啟動子系統具有較好的可控性,在黑麯黴中有很好的應用效果,Sun等通過用Tet啟動子系統替換土麯黴一個沉默NRPS-like基因的啟動子,成功誘導性啟動了該基因。土麯黴糖化酶Gla1的啟動子是最早被使用的土麯黴內源啟動子,1999年Villanueva等用該啟動子在土麯黴中异源表達輪狀病毒核衣殼蛋白VP6,但未能檢測到目的蛋白,可能是目的基因密碼子不匹配,也可能是由於土麯黴糖化酶系本就不發達,啟動子活性太弱。本文作者研究組為了更好地對土麯黴工業菌株進行代謝工程改造,對土麯黴內源基因3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gpdAt和檸檬酸合酶基因citA的啟動子進行了系統的比較表徵,獲得了簡短且高效的啟動子元件,最短的僅262 bp,克服了很多常用絲狀真菌啟動子過長(約2 kb)不利於操作的缺點。此外,還參照轉錄組資訊,將基因ATEG_02809、ATEG_03846、ATEG_09960(lovA)、ATEG_09961(lovB)、ATEG_09964(lovD)的啟動子應用於產洛伐他汀土麯黴工業菌株改造(未發表數據)。

(2)同源重組絲狀真菌一個非常顯著的特點是DNA雙鏈斷裂修復過程主要是依靠非同源末端連接途徑(non-homologous DNA end joining,NHEJ)和同源重組修復途徑(homology recombination,HR),這使得在絲狀真菌中外源DNA主要是通過隨機插入的管道綜合到基因組上,同源重組綜合效率非常低。其優點是當只需要表達某個目的基因時,可與篩選標記共轉化,得到表達元件綜合位點和拷貝數都有差异的轉化子庫,這些不確定性有利於篩選到效能更好的轉化子。其缺點也很明顯,依賴基因打靶的一些遺傳改造策略執行難度大,如基因敲除、基因定點表達、同源基因或突變體體內比較分析、啟動子替換等。研究人員在絲狀真菌模式生物粗糙脈孢菌中發現通過失活NHEJ途徑可以顯著提高外源基因的同源重組效率,從而解决基因打靶效率低的問題。這一科技很快被推廣應用,極大地促進了絲狀真菌的遺傳改造研究。本文作者研究組在土麯黴工業菌株中通過敲除ku80基因阻斷NHEJ途徑,成功將基因打靶效率從不到5%提高到90%以上,隨後進一步敲除pyrG基因獲得了尿嘧啶營養缺陷型底盤細胞,並建立了基於pyrGAn的雙向篩選遺傳轉化體系。最後結合改良後的Cre/loxP位點特异性重組系統對pyrGAn篩選標記進行快速切除,實現篩選標記的迴圈使用,解决了篩選標記不足的問題。利用這個遺傳操作平臺可以對土麯黴進行多基因、多位點、多策略的遺傳改造。

(3)基因編輯基於細菌和古細菌免疫機制開發的CRISPR/Cas9基因編輯科技,因其簡單、高效備受矚目,廣泛應用於各類生物細胞的遺傳改造研究中。由於缺乏質粒和可靠的强啟動子元件等,CRISPR/Cas9科技在絲狀真菌中的應用進度相對滯後。近幾年經過改良後也被成功地應用在越來越多的絲狀真菌中,包括粗糙脈菌、裡氏木黴、米麯黴、黑麯黴和玉蜀黍黑粉菌等。田朝光課題組在產纖維素酶嗜熱毀絲黴中利用CRISPR/Cas9科技實現了多個基因的同時敲除,顯示出了該科技在絲狀真菌基因編輯中的優勢和應用前景。現時,還沒有關於CRISPR/Cas9科技在土麯黴中應用的報導。

2降血脂藥物洛伐他汀的土麯黴細胞工廠

高血脂是心血管疾病的重要誘因,控制血脂水准是預防繼發心血管疾病的有效手段。他汀類藥物能够通過抑制羥甲戊二醯輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性來降低膽固醇的體內合成,成為最主要的降血脂藥物,占市場總額的80%以上。巨大的商業價值使得他汀類降血脂藥物研發成為最成功、最著名的藥物研發案例之一。洛伐他汀(lovastatin)是由土麯黴合成的一種聚酮類化合物,是首個被準予上市的他汀類降血脂藥物(美國食品藥品監督管理局FDA於1987年準予),備受矚目。

2.1洛伐他汀的生物合成

洛伐他汀,又名monacolin K,最早於1979年在紅麯黴中被首次發現,隨後Merck公司研究團隊發現土麯黴也能合成洛伐他汀,且具有更高的產量,並最終成功應用於洛伐他汀的工業生產。作為藝員小分子,土麯黴的洛伐他汀合成基因簇於1999年被首次鑒定,引起學術界的廣泛關注。通過一系列的反向遺傳學和生物化學研究,洛伐他汀的生物合成途徑被完全鑒定,整個合成途徑受特异性轉錄啟動因數LovE的調控,碳骨架主要由兩個還原型PKS(LovB和LovF)參與合成(圖2)。首先,LovB在烯醯基還原酶LovC的作用下合成dihydromonacolin L,然後在硫酯酶LovG的作用下從LovB的ACP結構域上釋放下來,接著在細胞色素P-450酶LovA的作用下發生羥基化和脫水作用生成monacolin L,隨後LovA繼續催化C8比特發生羥基化生成母核monacolin J。與此同時,另外一個PKS LovF負責合成2-甲基丁酸側鏈,在醯基轉移酶LovD的作用下轉移至monacolin J的C8比特羥基上生成終產物洛伐他汀。

圖2土麯黴洛伐他汀生物合成途徑

洛伐他汀工業生產菌株主要是通過誘變育種管道篩選獲得的,圍繞生物合成途徑的代謝工程改造的成功案例很少。LaeA是一個來源於構巢麯黴的次級代謝產物合成全域性調控因數,在土麯黴ATCC20542中過表達LaeA將洛伐他汀產量提高了4~7倍。在土麯黴ATCC20542中用組成型强啟動子PadhA替換乙醯輔酶A羧化酶ACCase的啟動子,强化前體供應,但是效果並不顯著,只將洛伐他汀產量從62.7mg/L提高到88mg/L。研究人員還發現敲除土麯黴ATCC20542的甾醇調節元件結合蛋白(SREBP)和SREBP分裂啟動蛋白(ACAP)分別將洛伐他汀產量提高了2.6倍和5.1倍。但是這些改造都是在普通低產菌株中進行的,洛伐他汀初始產量比工業菌株低了約兩個數量級,現時還沒有在高產菌株中成功改造的報導。

2.2合成生物技術策略改進辛伐他汀生產工藝

1992年,Merck公司又基於洛伐他汀開發了藥效更好的半合成衍生物辛伐他汀(simvastatin,Zocor),作為第二代他汀類藥物,迅速成為全球暢銷藥物,專利期過後年銷售額仍穩定達到30億美元。與洛伐他汀相比辛伐他汀只是在側鏈上多了一個甲基,在工業上辛伐他汀是以洛伐他汀為原料通過多步化學反應合成的,其生產工藝大致可分為三個步驟。首先是土麯黴發酵生產洛伐他汀,然後通過堿水解洛伐他汀獲得無側鏈的monacolin J,最後通過化學方法重新加上新的側鏈合成辛伐他汀。Tang課題組基於土麯黴的醯基轉移酶LovD建立了一種從monacolin J到辛伐他汀的生物催化方法,可替代原來的化學法,該成果獲得2012年美國總統綠色化學挑戰獎的綠色合成路線獎。至此,堿水解洛伐他汀生產monacolin J成為唯一未被生物催化替代的工藝,該過程複雜繁瑣、反應條件苛刻,而且需要使用大量的濃酸、濃堿和有機試劑,環境污染嚴重,囙此開發一種綠色高效的monacolin J生產工藝非常有必要。包括Merck在內的研究團隊也曾嘗試開發生物轉化方法,但是由於效率太低,都未能實現工業應用。

基於構建的土麯黴遺傳操作平臺,本文作者研究組以洛伐他汀工業生產菌株為底盤細胞進行系統的代謝工程改造,構建了能直接發酵生產monacolin J的土麯黴細胞工廠(圖3)。首先,鑒定了一個具有自主知識產權的洛伐他汀水解酶PcEST,能够高效地水解洛伐他汀的2-甲基丁酸側鏈生成monacolin J,催化效率達到國外專利酶的232倍。鑒於該酶的高效催化效能,利用內源啟動子PgpdAt構建了水解酶PcEST的真菌表達元件,並綜合至洛伐他汀土麯黴工業生產菌株的基因組上,使PcEST在土曲黴菌株中高效异源表達,成功將95%的洛伐他汀轉化成monacolin J,獲得了第一代生產monacolin J的土麯黴細胞工廠,打通了技術路線(圖3)。

圖3生產辛伐他汀前體物monacolin J土麯黴細胞工廠的設計策略

在工業生產中洛伐他汀殘留超過0.5%會新增分離純化的難度,而第一代細胞工廠有5%的殘留,會新增企業生產成本。研究組開發了水解酶PcEST高通量篩選方法,採用定向進化科技獲得了高效的水解酶PcEST突變體,結合啟動子優化構建了第二代細胞工廠,在實驗室條件下成功將殘留控制在0.5%以下,但是發酵條件變化對水解效率影響較大,穩定性不足並不適合大規模的工業生產。隨後,研究組通過基因組重測序對工業菌株的生物合成途徑和遺傳背景進行了分析,利用建立的高效遺傳操作平臺克服工業菌株遺傳背景複雜等困難,實現了負責側鏈合成的PKS基因lovF的完全敲除,成功阻斷了洛伐他汀合成的最後一步反應,實現了monacolin J的高效積累,獲得了完全無洛伐他汀殘留的第三代土麯黴細胞工廠。

真菌次級代謝產物的合成受環境因素的影響很大,這些外部因素在細胞內通過全域調控和特异性調控最終影響到整個合成途徑。會使得在工業生產過程中批次間波動很大,新增工藝控制難度,這一現象同樣存在於土麯黴發酵生產洛伐他汀的工業生產過程中。研究組在第三代產monacolin J細胞工廠的基礎上,以土麯黴內源組成型强啟動子PgpdAt過表達基因簇特异性轉錄調控因數lovE和構巢麯黴laeA,其中過表達laeA未能提高monacolin J的產量。而過表達lovE顯著加强lovE的轉錄並維持在較高水準,將monacolin J產量從10.73mmol/L提高到了16.36mmol/L,提高了52.5%。此外,還發現第三代菌株和過表達laeA菌株的monacolin J產量受培養基影響很大,在兩種不同培養基中的產量相差約30%,而過表達lovE的菌株在兩種不同培養基中發酵合成的monacolin J差异很小,這說明用組成型强啟動子過表達lovE有助於維持合成途徑的通量保持穩定,從而提高菌株的發酵魯棒性,對發酵環境變化有更好的適應能力。這項工作證明轉錄水准的改造是一種很有效的合成生物學改造策略,不僅能提高目標化合物的產量,還可以提高菌株的發酵魯棒性。這種改造策略在生產次級代謝產物的絲狀真菌工業菌株中應用較少,而該研究是一個可供參考的成功案例。

3生物基化學品衣康酸的土麯黴細胞工廠

衣康酸是由土麯黴發酵產生的一種不飽和二元有機酸,分子內部含有一個活潑的雙鍵和兩個羧基,雙鍵和羧基呈共軛關係,使得衣康酸的性質非常活潑,既可以自身聚合也能與其他單體發生聚合反應,囙此廣泛應用於化學合成工業,例如合成樹脂、塑膠、合成纖維和製藥領域等,應用前景廣闊。現時衣康酸的全球需求量約為4萬~6萬噸/年,年銷售額近10億元/年,並保持逐年增長趨勢,市場處於供不應求狀態。基於衣康酸的應用前景,美國能源部已將其列為十二種最具價值的生物基平臺化合物之一,引起廣泛關注。

3.1衣康酸生物合成途徑

土麯黴合成衣康酸很早就被發現和應用,但是直到2002年發現順烏頭酸脫羧酶CadA之後才確定它是通過順烏頭酸脫羧生成的,2008年獲得了CadA的核苷酸序列,並通過體外酶活和釀酒酵母中异源表達確定了其活性。2011年,Li等通過比較轉錄組分析發現cadA的轉錄水准確實與衣康酸產量呈正相關,而且還發現毗鄰的三個基因也表現出一致的變化趨勢,包括一個線粒體三羧酸轉運蛋白編碼基因mttA、一個MFS超家族轉運蛋白基因mfsA和一個轉錄調控因數,提示這三個基因可能也與衣康酸的合成相關,共同組成衣康酸合成基因簇。更有意思的是衣康酸基因簇與洛伐他汀基因簇相鄰,在發酵工藝研究中也初步發現兩者的合成具有相關性,但是尚未被更系統的研究證實。

基於前期的生物化學分析和近期的組學研究結果,提出了生物合成途徑的模型(圖4)。葡萄糖經糖酵解途徑後進行三羧酸迴圈生成檸檬酸,烏頭酸酶催化檸檬酸合成順烏頭酸,順烏頭酸在線粒體三羧酸轉運蛋白MttA的作用下轉運到細胞質中,然後由定位於細胞質的順烏頭酸脫羧酶CadA催化脫羧生成衣康酸,最後經MFS轉運蛋白MfsA分泌至細胞外。另外,檸檬酸也可能通過MttA轉運到細胞質中,然後由細胞質烏頭酸酶催化生成順烏頭酸,繼而合成衣康酸。雖然整個合成過程非常簡單,僅在TCA迴圈的基礎上多了一步由CadA催化的脫羧反應就能合成衣康酸,但是關於其合成的調控機制尚未研究。土麯黴工業菌株的衣康酸發酵產量可達到80g/L,糖酸轉化率高於60%。而三羧酸迴圈是高效的物質與能量轉換的覈心環節,順烏頭酸只是烏頭酸酶催化檸檬酸合成异檸檬酸反應過程中的一個中間體,絕大部分生物中只存在極少量順烏頭酸,囙此只有在特殊機制作用下土麯黴才能實現衣康酸的高效積累。

圖4土麯黴的衣康酸生物合成途徑

3.2衣康酸菌株代謝工程改造

土麯黴液體深層發酵生產衣康酸最早由輝瑞公司於1955年實現工業化應用,近20年隨著我國生物技術產業水准的快速發展,衣康酸發酵產業基本轉移到了我國。較高的成本(2美元/千克)仍然是限制其下游應用領域拓展的主要因素。雖然在工業生產過程中,通過菌株誘變和發酵工藝優化已經將產量提高到了80g/L,但之後近40年菌株效能沒能再進一步提高。隨著真菌遺傳改造科技的進步,菌株的理性改造被寄予厚望(圖5)。6-磷酸果糖激酶(PfkA)是糖酵解途徑中的關鍵限速酶,受下游產物檸檬酸和能量物質ATP的迴響抑制,為了解除通過PfkA靶點對糖酵解的迴響抑制,研究人員通過定點突變破壞磷酸化位點和删除抑制物結合區域的管道獲得活性更高且不受檸檬酸迴響抑制的PfkA突變體mtPfkA。隨後,將該突變體酶引入產衣康酸土曲黴菌株中進行异源表達,加快糖酵解途徑的通量,把衣康酸的產量從15g/L提高至30g/L,發酵週期由150h縮短為100h,效果顯著。但是該策略在工業菌株中應用時並沒有效果,可能是工業菌株產量已經遠高於30g/L,糖酵解通量已經很高,並非限速環節。

圖5產衣康酸土曲黴菌株改造策略

增强菌株的逆境抵抗力是合成生物技術研究的重要策略,有利於提高菌株的發酵强度。工業生產時發現發酵過程中攪拌和通氣的連續性非常重要,中斷5min就會延滯衣康酸的合成並顯著影響最終產量,說明在發酵過程中呼吸作用非常活躍且很重要,溶氧不足會打破平衡改變代謝流。為了提高菌株抵抗缺氧逆境的能力,Lin等通過在土麯黴中過表達透明顫菌血紅蛋白,把衣康酸的發酵產量由40g/L提高到46.8g/L。但在工業菌株中過表達透明顫菌血紅蛋白在正常的衣康酸發酵條件下未能提高產量,只在供氧不足條件下有小幅的改善。另外,在土麯黴發酵產衣康酸過程中,快速將大量葡萄糖轉化成服康酸,高强度呼吸作用會產生氧自由基,影響細胞活性,交替氧化酶(alternative oxidase,AOX)是線粒體呼吸鏈中交替呼吸途徑的末端氧化酶,研究表明它不僅有助於去除氧自由基還有助於提高細胞抗逆性。研究人員在產衣康酸土麯黴工業菌株中過表達土麯黴內源和來自黑麯黴的异源aoX1基因,衣康酸合成能力不但沒有提高,反而顯著下降(本文作者課題組未發表結果)。這一結果說明過表達的AOX確實在土麯黴中行使了功能,但是由於衣康酸積累機制較複雜,該改造策略整體而言並不有益於衣康酸的積累。可能是衣康酸積累機制和能量平衡有關,因為交替呼吸途徑會將正常的電子傳遞和能量合成過程進行解離,從而改變細胞能量狀態,影響衣康酸的高效積累。

基於生物合成途徑的解析,本研究組在工業生產菌株中對衣康酸合成途徑進行了系統的代謝工程改造。用强啟動子PgpdAt對衣康酸合成途徑中的關鍵酶(順烏頭酸脫羧酶CadA、檸檬酸合酶CitA、烏頭酸酶AcoA、丙酮酸羧化酶PYC、三磷酸甘油醛脫氫酶GPD和黑麯黴6-磷酸果糖激酶突變體mtPfkA)、轉運蛋白(線粒體三羧酸轉運蛋白MttA、衣康酸分泌蛋白MfsA)和調控因數(ATEG_09969、ATEG_01954)進行過表達。其中過表達順烏頭酸脫羧酶CadA將衣康酸產量從80.5g/L提高到88.1g/L,提高了9.4%,並且在生產中顯著縮短了發酵時間。MfsA被推測是負責將衣康酸分泌至細胞外的轉運蛋白,過表達MfsA將衣康酸產量提高了5%,這顯示MfsA確實與衣康酸分泌有關。但是過表達其他基因並沒有達到提高產量的效果。

除了合成途徑改造之外,研究人員還關注了衣康酸降解途徑。研究過程中發現土麯黴能够利用衣康酸作為唯一碳源進行生長,這說明土麯黴中存在降解衣康酸的途徑。通過轉錄組和體外酶活分析,發現衣康酸可以在衣康醯-CoA轉移酶AtIct、衣康醯-CoA水合酶AtIch和檸蘋醯-CoA裂解酶AtCcl的作用下轉化成丙酮酸和乙醯-CoA,重新回到中心碳迴圈中。在工業菌株中分別敲除這三個基因,基因缺失菌株的細胞提取物確實不再能降解衣康酸,但是在正常發酵條件下衣康酸產量無顯著變化。可能是衣康酸發酵過程中葡萄糖供應充足,且該條件下有利於衣康酸的合成和積累,降解途徑處於沉默狀態,囙此阻斷降解途徑無法提高衣康酸的最終產量。

此外,本文作者課題組通過對土曲黴菌株進行基因工程改造簡化了衣康酸發酵工藝。土麯黴的澱粉水解酶系不如黑麯黴發達,在工業上只能利用澱粉水解葡萄糖作為碳源進行發酵,而澱粉水解制糖需要經過澱粉酶處理、高溫噴射液化和糖化酶水解糖化過程,新增了生產成本。用强啟動子在土麯黴中异源表達來自黑麯黴的糖化酶gla1,並根據蛋白組數據進行信號肽優化,使土麯黴直接利用澱粉液化液發酵生產衣康酸的產量從約20g/L提高到了67.6g/L。再結合發酵工藝優化,產量達到78.2g/L,接近利用葡萄糖作為碳源時的產量,省去了澱粉液化液的糖化過程。

除了天然生產菌株的改造,也有研究嘗試通過合成生物技術用其他异源底盤細胞來生產衣康酸,包括檸檬酸生產菌株黑麯黴、解脂耶氏酵母、大腸桿菌等。但是合成能力仍遠低於土麯黴,圍繞土麯黴工業菌株的代謝工程改造仍然是重要關注點。現時土麯黴的改造雖然有一定效果但並未取得重大突破,其原因是關鍵的衣康酸積累機制尚不清楚。囙此,解析積累機制並進行針對性的改造仍值得期待,多個層面的機制均有可能。在酶學層面,通常烏頭酸酶催化檸檬酸轉化成异檸檬酸的過程中很少釋放並積累順烏頭酸,土麯黴烏頭酸酶可能具有特殊的酶學特性使其與其他物種不同,可以積累順烏頭酸進而合成衣康酸。在化合物迴響抑制層面,有研究顯示衣康酸能够抑制异檸檬酸裂合酶活性,囙此衣康酸的合成可以進一步抑制异檸檬酸經TCA的消耗,從而積累順烏頭酸合成衣康酸。另外,土麯黴合成衣康酸時需要限氮少磷的條件,提示可能存在物質合成與能量/還原力平衡調控。

4土麯黴次級代謝產物生物合成研究

絲狀真菌具有很好的次級代謝產物合成潜力,產生了許多與人類生活密切相關的重要次級代謝產物,如青黴素、他汀類降血脂藥物、免疫抑制劑環孢黴素以及食品色素等。這些化合物的生物合成主要是由覈心酶負責合成基本骨架,然後在修飾酶的輔助下合成更具結構多樣性的終產物,這些相關基因通常會在基因組上形成一個特异性的生物合成基因簇。根據覈心基因的不同,次級代謝產物通常可分為聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)合成的聚酮類、非核糖體肽合成酶(non ribosomal peptide synthetase,NRPS)合成的非核糖體肽類、萜烯環化酶(terpene cyclase,TC)合成的萜類和二甲烯丙基色氨酸合成酶(dimethylallyl tryptophan synthase,DMATS)合成的吲哚類等。近年來,組學研究發現絲狀真菌合成次級代謝產物的潜力被嚴重低估,次級代謝產物合成基因簇數量遠超預期,也遠多於該物種中已發現的次級代謝產物的數量,在實驗室基本培養條件下大部分基因簇都處於沉默狀態。如何挖掘這些潜在的次級代謝產物資源成為新的關注點,也陸續開發了很多啟動沉默基因簇策略,大致可以分為非特异性啟動和特异性啟動兩類。

非特异性啟動包括單菌多次級代謝產物方法(one strain-many compounds,OSMAC)、錶觀遺傳基因改造、化學錶觀遺傳和全域調控因數調控等策略。OSMAC是基於次級代謝產物生物合成受複雜的環境因素影響,通過優化發酵條件可以改變一些合成途徑的轉錄水准從而獲得不同的產物,常用的是優化培養基和培養條件,通過與放線菌共培養的方法也成功啟動一些化合物的合成途徑。此外,基因的轉錄還會受到錶觀遺傳的影響,組蛋白去乙醯化、甲基化和SUMO化等錶觀遺傳修飾會影響基因組局部區域是處於常染色質還是异染色質狀態,异染色質狀態下基因不會被轉錄或者轉錄不活躍。一些生物合成基因簇就是因為位於异染色質區域從而處於沉默狀態,敲除負責組蛋白去乙醯化的hdaA基因、甲基化的cclA基因或SUMO化的sumO基因都可以改變染色質的錶觀遺傳修飾,從而會影響或激活一些次級代謝產物的合成。化學錶觀遺傳策略則是通過在培養過程中添加相應的組蛋白修飾酶抑制劑來替代上述相關基因敲除,從而獲得類似效果。全域調控是真菌次級代謝產物調控的一個重要環節,LaeA是研究最多的一個真菌次級代謝相關的全域調控因數,在麯黴中普遍存在,通過敲除或過表達laeA常被用於促進或啟動某些次級代謝產物的合成。

特异性啟動策略包括覈心基因啟動子替換、特异性轉錄調控因數啟動和基因簇异源重構等。次級代謝產物骨架通常是由覈心基因負責合成,用可控强啟動子替換覈心基因的天然啟動子是發掘新化合物的一個有效手段。但是其缺陷也很明顯,次級代謝產物的合成通常是需要很多酶或輔助蛋白共同參與的複雜過程,包括產物的釋放、轉運和後修飾等,只啟動一個覈心基因得到的只是一個中間體或者根本無法得到產物。特异性轉錄調控因數啟動策略可以很好彌補這一不足,獲得了很好的應用效果。真菌次級代謝產物合成基因簇內通常會有一個轉錄調控因數,可以特异性地調控其所在基因簇的轉錄,從而調控代謝產物的合成。通過啟動子替換或者過表達方式啟動特异性轉錄調控因數,可以進一步啟動整個基因簇,從而獲得最終產物。除此之外,將基因簇在模式底盤細胞中進行异源重構也是一種常用的基因簇挖掘研究策略,常用的底盤細胞包括大腸桿菌、釀酒酵母、鏈黴菌和為絲狀真菌開發的構巢麯黴。异源重構策略對於沒有特异性轉錄調控因數的基因簇尤為重要。它的缺點在於基因簇通常較大,很難準確預測各基因的相關性和作用順序,目標基因數量多,操作難度大。

土麯黴作為洛伐他汀降血脂藥物開發的成功案例,其出色的次級代謝產物合成能力很早就受到研究者的關注,發現了很多新穎的化合物(錶1)。生物資訊學分析也證實了土麯黴確實具有强大的次級代謝產物合成能力,有31個PKS、17個NRPS、19個類NRPS以及2個PKS-NRPS雜合酶。除了洛伐他汀之外,近年來還有不少土麯黴基因簇被成功鑒定,並發現了絲狀真菌次級代謝產物合成新機制。但是,這些研究主要集中在PKS和NRPS類,萜類和吲哚類的研究還比較少。下文將對部分代表性研究工作進行介紹,包括化合物類型、生物合成途徑和研究方法。

錶1土麯黴已被研究基因簇及其下游產物

4.1聚酮類天然產物

聚酮是研究較多的一類次級代謝產物,土麯黴中共有31個PKS基因,其中13個的產物已經被鑒定。其中洛伐他汀基因簇和10,11-dehydrocurvularin基因簇都分別含有2個PKS基因,azasperpyranones基因簇含有3個PKS。

4.1.1土麯黴酮

土麯黴酮(+)-terrein是土麯黴中最主要的次級代謝產物之一,具有抗菌、抗癌、抑制植物生長等多種生物活性。土麯黴酮的結構於20世紀50年代被鑒定,隨後的生物合成途徑研究證明了其來源於聚酮合成途徑,是從一個6元環變到5元環,直到2014年其生物合成基因簇和合成途徑才被發現(圖6)。Zaehle等在挖掘土麯黴黑色素合成基因簇時,發現敲除nrPKS基因ATEG_00145(terA)使菌株失去了土麯黴酮合成能力。隨後通過生物資訊學和轉錄水准分析對其基因簇進行了預測,並進行了基因敲除驗證,結合异源重構提出了其生物合成途徑。TerA以乙醯輔酶A作為起始單元、以丙二醯輔酶A作為延伸單元,但它的產物鏈長控制並不嚴謹,會因延伸次數差异合成不同分子量的產物,當4個丙二醯輔酶A延伸單元被利用時會合成2,3-dehydro-6-hydroxymellein,進一步被TerB或其他酮還原酶還原為6-hydroxymellein,並最終在TerC、TerD、TerE和TerF的作用下形成終產物土麯黴酮。現時,具體在哪些酶作用下從六元環中間產物變成變成五元環土麯黴酮尚不清楚,有待進一步解析。隨後,該課題組還發現土麯黴酮生物合成至少受三種獨立的環境因素誘導,甲硫氨酸、限氮和缺鐵,這些環境因素通過全域調控因數AreA、AtfA和HapX將訊號最終傳遞至生物合成基因簇,誘導土麯黴酮合成。

圖6(+)-Terrein的生物合成基因簇及合成途徑

4.1.2土麯黴酸

土麯黴酸(terreic acid)也是一種從土麯黴中分離得到的quinone epoxide化合物,具有良好的抑制布魯頓氏酪氨酸激酶活性而成為潜在的癌症治療藥物,囙此受到關注。Boruta等通過OSMAC策略啟動了土麯黴ATCC20542中terreic acid的生物合成,然後根據生物資訊學分析推測其生物合成的是PKS ATEG_06275所在基因簇(從ATEG_06272到ATEG_06278),但是並未進行實驗驗證。2014年,Guo等將土麯黴中覈心基因atX(ATEG_06275)兩側從ATEG_06270到ATEG_06282的12個基因分別進行敲除,通過對敲除菌株發酵液的分析,鑒定了terreic acid的生物合成基因簇,並提出了初步的生物合成途徑假設,但是仍有一些問題未解决。隨後,蔡孟浩課題組通過在甲醇酵母中進行合成途徑的异源重構,修正並完善了terreic acid的生物合成途徑。由hrPKS AtX合成並釋放中間產物6-methylsalicylic acid,在脫羧酶AtA的催化下脫羧羥化形成3-methylcatechol,進一步在P-450單加氧酶AtE作用下生成3-methyl-1,2,4-benzenetriol,然後在被環氧酶AtD氧化羥基化生成terremutin,最後在氧化還原酶AtC的作用下形成terreic acid(圖7)。

圖7 Terreic acid的生物合成基因簇及合成途徑

4.1.3黃綠青黴素

黃綠青黴素(citreoviridin)是一種ATP合酶抑制劑,被作為乳腺癌靶向治療藥物研究。研究人員發現生物體中負責某抑制劑生物合成的基因簇中通常會存在一個額外的靶基因拷貝或者一個抗性基因,以這些抗性基因作為定位導向,可作為預測抑制劑類型次級代謝產物生物合成基因簇的有效策略。研究人員利用生物資訊學分析發現,citreoviridin的作用靶點ATP合成酶β鏈CtvE位於hrPKS CtvA(ATEG_09617)所在基因簇內,從而推測該基因簇即負責citreoviridin生物合成。Lin等通過在構巢麯黴中重構citreoviridin生物合成途徑,發現ctvA、ctvB、ctvC和ctvD即可實現citreoviridin的生物合成。首先,由覈心酶CtvA合成一個α-pyrone中間體,在SAM依賴型甲基轉移酶CtvB的催化下羥基甲基化生成citreomontanin,然後末端烯烴異構化形成(17Z)-hexaene,再被FAD單加氧酶CtvC雙環氧化,最終由水解酶CtvD催化tetrahydrofuran ring的形成,進而生成終產物citreoviridin(圖8)。

圖8 Citreoviridin的生物合成基因簇及合成途徑

4.2非核糖體肽類天然產物

非核糖體肽類化合物是由NRPS合成的含胺基酸次級代謝產物,土麯黴中共有17個NRPS基因,現時,其中4個的產物已經被鑒定。

Acetylaranotin是一種屬於多硫代二酮呱嗪(epipolythiodioxopiperizine,ETP)的類真菌毒素,通常具有獨特的二硫化橋或多硫化橋。根據絲狀真菌ETP類化合物生物合成基因簇系統發育分析,土麯黴中有兩個疑似NRPS基因ATEG_03470和ATEG_08427負責acetylaranotin的合成。2013年,Wang課題組通過基因敲除的管道確認ATEG_03470是acetylaranotin合成的覈心酶,敲除ATEG_03470之後不再合成acetylaranotin。進一步通過生物資訊學分析和體內基因敲除鑒定了acetylaranotin的生物合成基因簇,包括NRPS基因ataP(ATEG_03470)和8個相關基因,並基於敲除菌株中間產物積累和生物資訊學分析提出了生物合成途徑(圖9)。兩個苯丙氨酸在覈心酶AtaP的作用下形成二聚體cyclo-(L-Phe-L-Phe),由AtaTC中AtaC結構域催化發生雙羥基化,然後在AtaIMG的谷胱甘肽轉移酶結構域(AtaG)作用下結合兩分子谷胱甘肽,緊接著又通過二肽酶AtaJ水解脫去兩分子谷氨酸,在ATaIMG的碳-硫裂解酶結構域(AtaI)作用下繼續水解生成錶二硫醇中間體。AtaTC的巰基氧化酶結構域(AtaT)將游離的兩個巰基氧化形成跨環二硫化橋,並由P-450酶AtaF催化發生雙環氧化,進一步生成具有吡咯烷結構的中間體,然後在醯基轉移酶AtaH作用下乙醯化,最終通過苯甲酸對-羥化酶AtaY催化形成oxepine環,獲得acetylaranotin。

圖9 Acetylaranotin的生物合成基因簇及合成途徑

4.3類非核糖體肽天然產物

NRPS-like與NRPS的差异在於C結構域,被TE或R結構域所取代。土麯黴中共有19個NRPS-like基因,Wang課題組做了比較系統的研究,目前有6個已經完成了產物鑒定。

黑色素是自然界中一種常見的色素,真菌通過合成黑色素來抵禦逆境。真菌比較常見的黑色素是一種來源於真菌聚酮途徑的二羥基萘(DHN)類黑色素,但是基因組挖掘並未在土麯黴中發現合成DHN黑色素的PKS基因。Guo等發現在土麯黴中敲除NRPS-like ATEG_03563(atmelA)後,會產生白化的孢子。進一步的基因敲除和體外酶活等實驗證實ATEG_03563和酪氨酸酶ATEG_03564負責合成一種新的非典型孢子色素Asp-melanin,並提出了其生物合成途徑。兩分子的對羥基苯丙酮酸在AtmelA的作用下生成aspulvinone E,然後在酪氨酸酶TyrP的催化下發生羥基化生成不穩定的中間產物,並最終自發形成孢子色素Asp-melanin。在此期間研究人員還發現孢子色素Asp-melanin合成過程中存在空間調控現象(圖10)。AtmelA和ApvA(ATEG_02004)這兩個NRPS-like合成的產物都是化合物aspulvinone E,ApvA只在菌絲中產生aspulvinone E並最終形成aspulvinone類化合物,而AtmelA只在分生孢子中產生aspulvinone E,並最終參與孢子色素的合成。另外還發現,催化aspulvinone E形成aspulvinone H的异戊烯基轉移酶AbpB,同時還可以催化NRPS-like BtyA(ATEG_02815)的產物butyrolactoneⅡ發生類似的反應生成butyrolactone I。這種空間分佈可能是轉錄調控及酶定位的差异導致的,也說明真菌次級代謝產物合成具有複雜的調控機制。

圖10土麯黴Asp類黑色素的生物合成機制

4.4萜類天然產物

萜類是最豐富的一類次級代謝產物,結構新穎且活性好,在植物和真菌中都有大量存在。土麯黴有很好的萜類合成潜力,含有12個萜類生物合成基因簇,絕大部分還未被鑒定,值得關注。

4.4.1 Aspterric acid

Aspterric acid是一種強效除草劑,抑制二羥酸脫水酶(DHAD)的活性可達亞微摩爾級。土麯黴中aspterric acid的生物合成基因簇是通過抗性基因作為預測導向被發現的。研究人員分析發現DHAD同源基因astD位於一個萜類合成基因簇內,基因簇中包括一個TC基因astA(ATEG_04416),還有兩個細胞色素P-450酶基因astB和astC。由於該基因簇在土麯黴中是沉默的,Yan等將該基因簇中的基因逐步在釀酒酵母中异源表達,成功產生了aspterric acid和其中間體,從而解析了其生物合成途徑(圖11)。farnesyl diphosphate在AstA的作用下環化生成(-)-daucane,然後在AstB的作用下進一步氧化,將甲基轉化為羧酸並形成環氧化物,另一個甲基被AstC氧化生成羥基並推動分子內環氧化合物的開環,生成aspterric acid。

圖11 Aspterric acid的生物合成基因簇及合成途徑

4.4.2土曲雜萜

土曲雜萜(terretonin)是土麯黴中一種聚酮-萜類雜合的混源萜類化合物,早在20世紀80年代,研究人員就用同位素標記證明terretonin的合成包括聚酮和萜類途徑。這說明其生物合成應該同時需要PKS和异戊烯基轉移酶參與。Guo等通過生物資訊學分析,發現nrPKS基因ATEG_10080(trt4)附近有一個异戊烯基轉移酶基因ATEG_10078(trt2),這表明trt4和trt2可能參與terretonin的合成。隨後基因敲除實驗證實了這一推測,結合與構巢麯黴austiol合成基因簇的比對分析結果,最終確定了合成terretonin基因簇的範圍,並初步提出了terretonin的生物合成途徑假設。Matsuda等通過在米麯黴中异源重構的管道進一步完整解析了terretonin的生物合成途徑。即Trt4負責合成並釋放聚酮化合物3,5-dimethylorsellinic acid(DMOA),然後farnesyl pyrophosphate(FPP)與DMOA在Trt2的催化下生成farnesyl-DMOA,緊接著依次在Trt5、Trt8、Trt1、Trt9、Trt3的作用下發生甲基化、環氧化、環化、氧化和羥基化生成terrenoid,隨後在多功能P-450酶Trt6和異構酶Trt14共同作用下形成terretonin D,最終由Trt7催化兩次氧化生成terretonin(圖12)。該雜合化合物是由基因簇內兩個不同類型覈心酶共同參與合成的。

圖12 Terretonin的生物合成基因簇及合成途徑

4.5聚酮-非核糖體肽雜合天然產物

PKS-NRPS雜合酶是一類比較特殊的次級代謝產物合成覈心酶,此類酶中同時含有PKS和NRPS模塊,囙此其產物通常是聚酮和胺基酸的含氮複合物,結構新穎,所以受到關注。土麯黴NIH2624基因簇注釋結果顯示土麯黴只有一個PKS-NRPS雜合酶基因ATEG_00325。近期,本研究組通過基因組挖掘策略在土麯黴中又發現了一個PKS-NRPS雜合酶ATEG_00913。

4.5.1异戊二黴素

PKS-NRPS雜合酶編碼基因ATEG_00325所在基因簇在實驗室條件下是沉默的,Gressler等研究發現該基因簇的表達受部分胺基酸的誘導和糖的抑制,RT-PCR分析顯示在產生异戊二黴素(isoflavipucine)的條件下與ATEG_00325相鄰的一些基因的轉錄水准有相關性,預測isoflavipucine的生物合成基因簇可能包含ATEG_00325、ATEG_00326、ATEG_00329、ATEG_00330、ATEG_00331這五個基因,並且通過同位素標記實驗推測了其可能的生物合成途徑,但是很多關鍵的反應還有待實驗驗證(圖13)。這項研究不僅提出了一種系統誘導真菌沉默基因簇的方法,還關注到了初級和次級代謝產物之間的緊密聯系。

圖13 Isoflavipucine的生物合成基因簇及合成途徑

4.5.2土曲吡喃酮

土麯黴MEFC01重測序後進行antiSMASH分析發現了之前被注釋為PKS的ATEG_00913(pytA)其實是一個PKS-NRPS編碼基因。由於該基因簇在實驗室條件下是沉默的,本研究組用土麯黴內源組成型强啟動子PgpdAt替換基因簇中特异性轉錄調控因數ATEG_00919的天然啟動子,成功啟動了這個沉默的基因簇,發現該基因簇合成一類土曲吡喃酮(pyranterreones)化合物。隨後,通過胺基酸13C標記管道確定雜合酶的NRPS模塊是選擇絲氨酸作為延伸底物,結合基因敲除結果提出了這類聚酮-胺基酸雜合化合物的生物合成途徑(圖14)。該研究從基因組測序到沉默基因簇啟動,再到基因敲除和分子探針標記,是絲狀真菌次級代謝產物基因組挖掘的一個成功案例。

圖14 Pyranterreones的生物合成基因簇及途徑

4.6合成一個目標天然產物的兩個獨立基因簇間的協同調控機制

如上所述實例,次級代謝產物的合成通常只含有一個覈心基因,只有少數基因簇中含有兩個覈心基因,如洛伐他汀基因簇含有兩個PKS。另外,次級代謝產物合成相關基因通常位於同一個基因簇內,極少有兩個獨立的基因簇共同合成一個化合物。近期,本研究組在土麯黴中發現了一種複雜新穎的絲狀真菌次級代謝產物合成及調控機制(圖15)。

圖15兩個獨立基因簇協同合成化合物azasperpyranones

基因簇A含有ATEG_03629(nrPKS)和ATEG_03630(NRPS-like)兩個覈心基因,基因簇B含有ATEG_07659(hrPKS)和ATEG_07661(nrPKS)兩個覈心基因,由於這兩個基因簇在實驗室基本培養基條件下是沉默的,以前報導都只是通過异源重構管道進行了初步鑒定。Zhao課題組在釀酒酵母中异源表達了ATEG_03629和ATEG_03630這兩個覈心酶基因,發現其能够合成5-甲基苔色醛。Wang課題組通過在構巢麯黴中异源重構ATEG_07659/ATEG_07661基因簇,發現該基因簇能够合成asperfuranone。本研究組通過培養條件優化成功啟動這兩個基因簇,並意外發現這兩個獨立基因簇共同參與合成一類含有6/6/6/6稠環(6/6/6/6 tetracyclic system)的新化合物azasperpyranones。在此基礎上,進一步通過體內基因敲除和體外酶學驗證,對兩個基因簇內各基因進行了功能分析,系統解析該類化合物的生物合成途徑。同時,還發現這兩個獨立的基因簇之間雖然存在空間距離,但是存在一種由三個轉錄調控因數介導的多層級轉錄調控,使得它們能够相互協調共同參與同一個化合物的合成。

這是首次在絲狀真菌中發現由兩個獨立的基因簇中的四個覈心基因共同合成一個次級代謝產物,也是首次發現兩個獨立基因簇在多層級的協同調控機制下共同作用,這種合成機制有助於生物合成結構更加複雜的化合物,並獲得更加有益於生存的生物活性。該發現對於研究絲狀真菌合成複雜化合物的生物機制具有重要意義,為真菌次級代謝產物生物合成途徑解析和新型天然產物基因組挖掘提供了新思路。

5土麯黴底盤細胞的合成生物技術應用前景

很多具有應用價值的次級代謝產物由於天然宿主調控機制複雜、培養難度大或者週期較長等因素,生產效率非常低,嚴重阻礙了其應用開發前景,例如植物、難培養微生物和一些極端微生物。隨著合成生物學近年來的快速發展,構建目標產品導向的异源高效微生物細胞工廠成為研究熱點。將完整的合成途徑在底盤細胞進行异源重構,以避免天然宿主的特异性調控,從而實現高產,而在此過程中底盤細胞的選擇非常重要。通過工業發酵生產衣康酸和洛伐他汀,土麯黴展現出了强大的初級代謝產物和次級代謝產物生產能力,以及良好的工業發酵效能,生長快速、營養需求簡單且碳源利用率高,工業生產具有高效率、低成本的優勢。並且土麯黴產孢能力强、抗逆性能好,菌絲體發酵形態適合大規模發酵,在我國已經建立了成熟的土麯黴發酵工藝,最大單罐體積300t。由此可知,這些土麯黴工業菌株具備作為底盤細胞用於合成生物技術開發不同目標產品的優良條件,工業發酵放大難度相對較小,有利於實現最終的產業化應用。

5.1次級代謝產物基因組挖掘的异源底盤細胞

在异源底盤細胞中重構合成途徑是鑒定沉默基因簇的一種有效方法,真菌天然產物由於其生物合成機制的一些特殊性,使得其在大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物中很難高效异源重構。首先,大腸桿菌屬於原核生物,缺少真核生物轉錄後mRNA剪接機制,釀酒酵母雖然屬於真核生物,但是並不能很準確地識別其它真核生物基因內含子和外顯子,异源表達時都需要使用目的基因的cDNA,尤其是在基因簇包含的基因較多時操作難度會較大。其次,由於缺少相關的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶,PKS和NRPS在野生型大腸桿菌和釀酒酵母中都沒有活性,通過引入合適的外源磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶可以解决該問題,但是活性仍舊較低。另外,真菌P-450催化系統與原核生物的具有一定特殊性,還原伴侶不能通用,而且絲狀真菌P-450酶在細菌或釀酒酵母中功能性表達難度很大。絲狀真菌作為异源表達宿主可以很大程度上避免這些問題,可以準確地完成其他真菌來源基因轉錄後的後修飾,不需要額外去除基因中的內含子,可以實現合成基因簇的整體轉移綜合。研究人員開發並利用構巢麯黴作為底盤細胞成功鑒定了一些真菌沉默基因簇的產物,這說明用絲狀真菌作為底盤細胞是切實可行的。但是,如果底盤細胞次級代謝產物本身的合成能力較弱,獲得產物量會很少,會新增後續研究的難度。產洛伐他汀土麯黴工業菌株具有很高的洛伐他汀產量,這說明其次級代謝產物合成能力强,合成前體供應充足,P-450催化系統高效,更容易實現目標途徑化合物的高產,有助於新型天然產物生物合成途徑解析研究。

5.2聚酮類化合物高效合成的細胞工廠

聚酮類化合物在絲狀真菌、蕈菌和植物中廣泛存在,並顯示出很好的應用價值,如藥物和天然色素等,很多中藥的活性成分也是聚酮。有些化合物由於產量太低或者培養種植效率太低,大量製備難度大,成本很高,限制了其下游研發或推廣應用。土麯黴工業菌株卓越的洛伐他汀生產能力說明其聚酮類天然產物合成的上游途徑非常發達,作為底盤細胞用於生產其他异源次級代謝產物,尤其是聚酮類化合物時可以保證充足的底物供應,是目標化合物高產的重要保障。例如,蒽醌類化合物大黃素是中藥大黃的主要活性成分,也是一種天然色素,由於中藥植物種植效率低、限制多,使得其成本很高且產能很低,應用市場受限。近期,本研究組以產洛伐他汀土麯黴工業菌株作為底盤細胞,開發了能直接合成大黃素的細胞工廠,初步搖瓶發酵產量達到了2g/L。這說明土麯黴確實是聚酮類化合物生物合成的理想底盤細胞,至於其他類型天然產物的適用性有待評估。而且,成熟的土麯黴工業發酵基礎,使其相較於其它底盤細胞開發的細胞工廠,在發酵規模放大方面難度相對較小,更具產業化競爭力。

5.3高值有機酸生物合成的細胞工廠

如前所述,產衣康酸土曲黴菌株能快速地通過中心代謝途徑,將簡單的葡萄糖碳源轉化成服康酸,其他有機酸副產物極少,說明它具有很好的葡萄糖攝取及轉化能力。而且該菌株具有很好的低pH耐受能力,發酵初始pH約4.0,開始產酸後pH可降至2.0。例如,反式烏頭酸是一種不飽和三羧酸,具有很好的殺線蟲活性和成為具有重要應用價值生物基化學品的潜力,但是由於缺乏可靠的生產方式,其應用潜力未能挖掘。近期,本研究組以產衣康酸工業菌株為底盤細胞,將其改造成能够發酵生產反式烏頭酸的細胞工廠,初步的20t發酵罐示範產量達到30g/L。發酵過程中pH低至1.5,在該條件下大腸桿菌和酵母等底盤細胞很難正常生長。囙此,在設計初級代謝產物細胞工廠時,尤其是酸性化合物,土麯黴是一種可供選擇的底盤細胞。

6展望

隨著合成生物技術的快速發展,很多微生物底盤細胞被陸續開發和應用。土麯黴作為絲狀真菌底盤細胞,因其卓越的發酵效能和成熟的工業應用基礎而受到關注。相較於現時已經開發相對成熟的其他模式微生物體系,土麯黴合成生物技術研究還有很多不足之處需要加强。首先,可選用的遺傳元件少,如篩選標記、啟動子和終止子等,遺傳元件是合成生物技術開發的基礎模塊,遺傳改造元件庫的建設將是一個重要研究任務。尤其是啟動子,包括土麯黴在內的絲狀真菌啟動子元件很少進行系統表徵,其强弱及變化趨勢都不明確,這也使得絲狀真菌現時還很難像大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物那樣進行相對定量可控性的遺傳改造。其次,CRISPR/Cas9基因編輯科技有待開發,一些絲狀真菌中已經成功開發了CRISPR/Cas9基因編輯科技,展現出明顯先進性的同時也有一些不足,比如編輯效率比在酵母中要低得多,不同基因位點的編輯效率也不同,還有應用策略有局限性,現時還僅限於基因的定點突變、替換和敲除破壞。在開發適用於土麯黴CRISPR/Cas9基因編輯科技的同時應該努力改善上述缺陷。最後,細胞工廠效能評估也是合成生物技術開發的一個重要環節,相較於單細胞微生物,多細胞真菌的高通量分析難度更大,開發可靠的高通量篩選和發酵評估方法將是一個很具挑戰的任務。加强上述研究將顯著提升土麯黴及絲狀真菌合成生物技術研究水准,提供更多可供選擇的設計策略,構建更加高效的土麯黴細胞工廠。此外,這些也是絲狀真菌相關研究中的共性問題,土麯黴合成生物技術研究也將促進其他絲狀真菌的發展。

原文刊載於《合成生物學》期刊

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本文標題: 工業絲狀真菌土麯黴合成生物技術研究進展及展望
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