高等院,|,蛋白質設施用戶闡明黃嘌呤核開關複合物結構及調控機制

核開關是一類位於mRNA5’端非編碼區域的不依賴於蛋白可直接調控基因表達的RNA元件,可以形成特定的三維空間結構。現時已經發現和報導的核開關有四十餘種,其可識別的小分子涵蓋胺基酸,陰離子,金屬離子,輔酶因數及其衍生物,嘌呤核苷酸及其衍生物等。

近日,國家蛋白質科學研究(上海)設施用戶浙江大學生命科學研究院任艾明課題組與奧地利因斯布魯克大學Ronald Micura課題組合作在Nucleic Acids Research雜誌上發表題為“Insights into xanthine riboswitch structure and metal ion-mediated ligand recognition”的研究論文,報導了特异性結合黃嘌呤的天然核開關NMT1motif的晶體結構,揭示了由金屬離子介導的黃嘌呤核開關對配體識別的原理。

核開關(Riboswitch)是一類位於mRNA 5’端非編碼區域的不依賴於蛋白可直接調控基因表達的RNA元件,可以形成特定的三維空間結構。這類RNA元件含有兩個不同功能的結構域,適配體模塊(aptamer domain)可以特异性地識別小分子配體,並發生構象改變,從而誘導位於下游的基因表達調控模塊(expression platform)的構象也隨之發生改變,進而在轉錄或翻譯水准上促進或者抑制相關蛋白的表達。現時已經發現和報導的核開關有四十餘種,其可識別的小分子涵蓋胺基酸,陰離子,金屬離子,輔酶因數及其衍生物,嘌呤核苷酸及其衍生物等。

嘌呤及其衍生物是一類豐富的代謝物,廣泛地存在於生命體中並發揮重要的生理作用。細胞內嘌呤的含量受到嚴格的調控,這些過程的失調會導致嚴重的細胞紊亂。黃嘌呤(圖A)是嘌呤降解代謝過程中產生的氧化產物,可在黃嘌呤氧化酶的作用下繼續氧化為尿酸,廣泛存在於人體及其他生物體內。黃嘌呤還可用作溫和的興奮劑和支氣管擴張劑,常用於治療哮喘症狀。2020年,耶魯大學的Ronald Breaker課題組在變形杆菌中鑒定出一類新型RNA結構模塊(motif)NMT1,隨後發現NMT1能够以微摩爾級別親和力與黃嘌呤結合,囙此將其稱為黃嘌呤核開關。二級結構研究表明黃嘌呤核開關主要含有兩個莖區P1和P2,它們由一個大的Junction(J1)連接;其中莖區P2又被中間含有的一個小Junction(J2)分為P2a,P2b兩個小莖區。進一步分析顯示,黃嘌呤核開關中位於連接處的核苷酸序列高度保守(圖B)。

為了闡明黃嘌呤核糖開關識別其配體的原理以及其對嘌呤代謝通路的調控作用,任艾明課題組利用X-射線晶體學的方法,解析了來自Ideonella sp.B508-1中的黃嘌呤核開關與黃嘌呤的複合物結構(圖C)。複合物的三維結構顯示,黃嘌呤核開關RNA整體折疊為一個緊湊的長杆狀I形構象,莖區P1,P2a,P2b在三維空間中連續堆積形成長的螺旋軸。兩個Junction(J1,J2)通過G35和C11之間的Watson-Crick配對形成遠程相互作用,穩定了黃嘌呤核開關的整體結構。配體結合口袋處於莖區P1和P2a之間的連接區,其中黃嘌呤與G10和U40作用形成一個三堿基層,該三堿基層被進一步夾在兩個三堿基對A39-G35-C11和A6-U41-A9之間,成為長螺旋軸的重要組成部分(圖D,E)。此外,結構中還發現,黃嘌呤結合位點附近存在三個金屬離子Mg2+(M2,M3,M4),它們通過直接作用或者配比特水分子的介導,與配體黃嘌呤以及形成結合口袋的核苷酸形成廣泛的氫鍵相互作用,進而穩定結合口袋的形成(圖F)。基於結構,課題組對結合口袋中的關鍵堿基進行了特异性突變,隨後通過ITC親和力測定以及2-Ap修飾RNA分子的螢光光譜分析,進一步驗證了黃嘌呤核開關對黃嘌呤特异性識別的結構特徵。

本項研究通過解析黃嘌呤核開關的三維空間結構以及體外的突變體親和力驗證,揭示了其與配體高特异性結合的分子基礎,闡明了細菌通過RNA分子調控嘌呤代謝的作用機制。同時,新的RNA結構也進一步豐富了RNA分子的結構資料庫。此外,黃嘌呤作為一種重要的生物鹼,可衍生出多種黃嘌呤類藥物,同時還是嘌呤代謝的中間產物,與痛風等疾病息息相關,黃嘌呤核開關RNA結構的解析為發展抗生素、生物感測器等應用提供必要的結構基礎。

國家蛋白質科學研究(上海)設施BL19U1線站、BL18U1線站及BL17B1線站,上海光源BL17U1線站工作人員為其X射線晶體學繞射數據收集提供了及時有效的支持。

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