8月9日，國際病毒學權威學術期刊PLOS Pathogens線上發表了復旦大學上海醫學院醫學分子病毒學重點實驗室袁正宏課題組與上海市（復旦大學附屬）公共衛生臨床中心共同合作的題為“Probing the spatiotemporal patterns of HBV multiplication reveals novel features of its subcellular processes”的研究論文。課題組利用獨立原創的高靈敏螢光原位雜交（FISH）方法揭示了HBV感染肝細胞的核酸動力學及細胞核內病毒共價閉合環狀DNA（cccDNA）表觀遺傳學特性，分析了病毒前基因組RNA（pgRNA）在單分子層面的翻譯與複製包裝的序貫過程，揭示了細胞微管結構在核衣殼運輸和病毒成熟分泌過程中的關鍵作用。
乙型肝炎病毒（Hepatitis Bvirus，HBV）感染是世界性的重大公共衛生問題。世衛組織報導全世界約有2.57億人慢性感染乙肝病毒，約有88.7萬人死於與乙肝病毒感染相關的終末期肝病，如肝硬化、肝功能衰竭和肝癌。由於HBV具有高度複雜的複製增殖機制，已有的治療手段尚不能治癒乙肝，進一步加深對HBV複製週期關鍵環節的認識可以為乙肝的徹底治癒提供新的線索。
前人對HBV生命週期的研究主要依賴密度梯度離心、Southern和Northern blot等一系列經典分子生物學科技。然而，上述方法無法提供病毒在細胞內的精確定位，損失了與多種亞細胞器的相互作用的關鍵資訊。袁正宏課題組利用基於bDNA的螢光原位雜交結合免疫螢光科技，開發了一種用於多重檢測病毒核酸和蛋白質的顯微成像方法，其優勢在於能够定量出單細胞水准病毒核酸的表達差异，以及不同類型病毒核酸在細胞核與細胞漿之間的分佈特徵。
研究人員首先證實了HBV子代病毒核酸緩慢複製的動力學特徵，同時在單細胞水准揭示了病毒複製的高度異質性。接著通過直接觀察細胞核內cccDNA與關鍵錶觀遺傳標記（組蛋白H3賴氨酸27位點乙醯化（H3K27ac）和RNA聚合酶II（PolII））的共定位，定量分析了病毒微小染色體與轉錄啟動相關標記的共定位。此外，還進一步證實了Smc5/6複合物在感染的原代肝細胞中被降解，而在感染的HepG2-NTCP細胞中無明顯降低，提示在肝癌細胞系中這一通路與正常肝細胞有顯著差异。
在細胞漿中的病毒活動方面，課題組在單分子水准定量分析了病毒前基因組RNA（pgRNA）與核糖體和核衣殼的共定位情况，證實pgRNA作為蛋白翻譯範本和核衣殼包裝的基因組前體是序貫發生，無法同時完成的獨立分子事件，且後者較前者更加緩慢。最後，研究發現儘管細胞微管結構被小分子抑制劑破壞後核衣殼仍可以組裝，但核衣殼的胞內運輸受阻，滯留於細胞核周。此外，微管還為多囊泡小體（Multivesicular Bodies，MVBs）中的小囊泡融合介導病毒粒子分泌出胞提供了細胞內“高速公路”，揭示了病毒如何利用胞內結構有效產生成熟病毒顆粒的策略。
這項研究主要利用視覺化科技證實了HBV關鍵複製環節的現有知識，並且在亞細胞水准可直接觀察病毒組分利用宿主因數進行複製的關鍵機制，填補了HBV生活史中一些關鍵環節的時空資訊，深化了對HBV感染的認識，為開發新的抗病毒策略提供了嶄新視角。同時，該研究開發的相關方法也為研究病毒組分與宿主間的相互關係提供了有力的科技支撐。
該研究得到了國家自然科學基金重大研究計畫、國家科技重大專項、廣東省珠江人才計畫地方創新團隊項目、中國醫學科學院醫學創新基金、上海市科委基礎研究重大專項的資助。此次發表的研究論文，嶽蕾和李暢為第一作者，袁正宏研究員和張小楠研究員為共同通訊作者。徐明珠、鄔敏、丁家惠和劉江霞等也為該研究作出了重要貢獻。
論文連結：https://journals.plos.org/plospathogens/article？id=10.1371/journal.ppat.1009838&rev=2
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