揭示工程化設計的人工合成途徑與底盤細胞整體代謝網路的交互作用及適配性機制是合成生物學研究的關鍵共性科學問題。細胞內醯基CoA是微生物合成生物活性物質如聚酮、芪類及黃酮類、生物鹼、生物能源及生物資料等的前體，提高細胞內醯基CoA供應水准，能够促進微生物合成產率升高；醯基CoA也是蛋白質醯基化修飾的醯基基團供體，醯基CoA積累導致合成代謝途徑相關酶的醯基化水准提高，抑制代謝酶催化活性及合成效率。本文從醯基CoA平衡及醯基化修飾的角度，重點闡述了醯基CoA雙重效應（醯基化供體及代謝前體）的相互影響與平衡，隨後通過紅黴素、丁醇、赤松素的實例總結了翻譯後修飾代謝工程在調節微生物合成途徑各元件間、合成途徑與底盤之間的適配性，促進產物合成方面的實際應用。
自20世紀初創建以來，合成生物學突破了傳統的“自上而下”理念，形成了以人工設計為主導、系統化和標準化生物技術為手段的“自下而上”正向工程學思路，構建標準化和通用型的生物元件模塊（如基因線路、酶、代謝途徑等），在簡約型底盤細胞中進行綜合、測試和優化，實現定量可控的平臺化新生命系統的高效運行。基於合成生物學的工業生物技術也成為了解决當前人類健康、資源、能源和環境等問題最具潜力的科技方法。在合成生物學的飛速發展過程中，產物合成覈心元件的標準化及其與底盤細胞的適配性則是制約人工生物合成系統“能力提升”的“卡脖子”問題。為了克服這一難題，我們必須解决以下幾個基礎問題：闡明合成代謝調控機制，建立微生物合成的理論與方法，設計及構建人工微生物合成體系（工程化菌種），實現生物合成的定向性和高效性。
現有的產業化應用菌株主要是通過傳統的隨機選育方法或單一代謝途徑修飾的方法獲得。生物學家逐漸發現，傳統的代謝工程方法僅僅通過合成途徑的優化改造，對於高效生物合成的作用是非常有限的，甚至導致對細胞行為的不良影響，危及整個工程菌的效能。隨著生命科學科技的發展，系統生物技術方法、網絡調控分子機制、人工元件設計及模型優化已經越來越滲透到微生物合成體系研究領域，微生物高效合成產物主要取決於合成途徑中關鍵節點酶的催化效率及前體供應，考慮到合成代謝通路的動力學控制並不僅僅局限在一個單獨的反應或途徑中，而是分佈在整個網絡甚至整個系統中，微生物合成的工程改造必須從單個代謝通路的優化轉變到代謝調控網絡及生物系統的優化（圖1）。囙此，加深理解微生物合成代謝與調控的分子基礎，揭示工程化設計的（內源及外源）生物合成體系與細胞整體代謝網路的交互作用及適配性機制是當前微生物合成理論與方法研究的重要方向。
圖1底盤細胞對人工生物合成途徑的影響
（基因表達調控、前體及輔因數供應、酶活性調控和產物轉運等）
微生物擁有極其複雜的調控網絡和響應機制以應對培養環境及胞內代謝狀態變化，利用多種調控模式調節胞內代謝網路及代謝流分佈。已有的研究表明，微生物細胞調控其（內源性或嵌入性）工程化設計生物合成體系有以下3種管道：基因轉錄及翻譯調節胞內代謝酶豐度；變構效應及翻譯後修飾調控胞內代謝酶活性；前體供應及輔因數濃度影響合成代謝反應速率。與此同時，代謝工程及合成生物學的研究重點也相應地聚焦在：生物合成元件的挖掘、設計、優化、改造及組裝；調控元件及調控網絡優化，維持合成代謝酶的高表達；前體及輔因數工程，强化前體與輔因數供應；代謝酶優化改造，解除產物的變構迴響抑制。這些分工明確的系統性研究深化了對微生物合成理論與方法的理解，實現了微生物藥物、生物燃料及化學品、生物基聚合物的高效合成。然而，作為微生物固有體系的組分，翻譯後修飾（post-translational modification，PTM）系統對工程化生物合成途徑的調控機制及合成效率的影響仍缺乏系統研究，基於翻譯後修飾的代謝工程及合成生物學也鮮有報導。
1醯基CoA與蛋白質醯基化修飾
蛋白質翻譯後修飾是一種所有生命體都廣泛存在的重要調控機制，主要包括磷酸化、甲基化、醯基化等。PTM能够通過酶活性調節，改變亞細胞定位、與分子伴侶間相互作用、蛋白質穩定性及其與DNA結合能力等管道，賦予其修飾蛋白質全新的功能和性質。
以醯基化為代表的蛋白質翻譯後修飾一直是廣受追捧的研究熱點。1964年Allfrey和同事首次在真核細胞中，發現了組蛋白的賴氨酸存在乙醯化修飾，並指出這種乙醯化修飾具有重要的轉錄調控功能；1997年非組蛋白（如腫瘤抑制蛋白p53）中也發現了賴氨酸乙醯化修飾的存在；2002年更進一步發現了原核細胞中可逆賴氨酸乙醯化（reversible lysine acylation，RLA）對乙醯CoA合成酶活性的調控機制。隨著高解析度質譜科技的發展，越來越多的研究證實RLA是一種真核細胞及原核細胞中都廣泛存在的蛋白質功能調控模式。
蛋白質的乙醯化是一個動態可逆的過程，生物體存在兩種蛋白質乙醯化機制：①酶催化機制，通過乙醯轉移酶將乙醯CoA上的乙醯基團轉移到賴氨酸側鏈氨基；②非酶乙醯化機制，醯基化反應是高放熱反應，且形成的醯胺鍵非常穩定，細胞內高濃度的乙醯CoA或乙醯磷酸（AcP）在鹼性pH條件下可自發乙醯化蛋白質賴氨酸的側鏈氨基。由於兩種乙醯化機制（酶催化和非酶催化）在細胞中同時存在，現時尚無有效方法區分底物蛋白的乙醯化修飾是由哪種機制產生。去乙醯化反應是蛋白質乙醯化的逆向反應，在酶催化和非酶催化的乙醯化反應中，有部分能通過去乙醯化酶的催化脫去乙醯化，另一部分則不能發生去乙醯化，細胞如何處理這些不能脫去乙醯化的蛋白質的機理尚不明確。
乙醯化中和了賴氨酸ε-氨基的正電荷，提高其疏水性的同時增大賴氨酸側鏈體積。囙此，賴氨酸的乙醯化會抑制其側鏈形成氫鍵，及其與負電荷殘基發生靜電相互作用的能力，卻能新增與其他蛋白相互作用的范德華力。除了乙醯基基團之外，其他醯基基團也可以醯基化賴氨酸的側鏈氨基，如丙醯化、丁醯化、琥珀醯化、丙二醯化、戊二醯化、巴豆醯化、β-羥基丁醯化，以及最新發現的苯甲醯化、乳酸化等。不同的醯基化修飾造成了蛋白質結構和性質的多元性，以調節酶催化活性、蛋白質穩定性或與其他分子間相互作用的管道影響細胞的代謝過程。根據醯基基團性質的不同，醯基化修飾可分為3類：①疏水非極性醯基化，例如丙醯化、丁醯化和巴豆醯化，它們在乙醯化賴氨酸殘基的基礎上，延伸了烴鏈，進一步新增其疏水性；②極性醯基化，例如β-羥基丁醯化和2-羥基异丁醯化，其特點是包含一個可與其他分子形成氫鍵的羥基；③酸性醯基化，例如丙二醯化、琥珀醯化和戊二醯化，這種類型的醯基化修飾能使賴氨酸電荷由+1變為−1，電荷改變程度與磷酸化相當（由0到−2），囙此，這類醯基化修飾與前兩類差异顯著。這些修飾基團結構和功能的多樣性無疑新增了蛋白質修飾機制與調控研究的複雜性。
醯基化修飾的發生與基礎營養代謝的失衡緊密相關。微生物細胞內氮源匱乏或碳流溢出導致胞內AcP和乙醯CoA積累，繼而引發高水准的蛋白質乙醯化，這些乙醯化蛋白多為代謝酶並且大量分佈於TCA迴圈、糖酵解、脂肪酸代謝、丙酮酸代謝等多種中心代謝途徑，緩衝碳流過量帶來的壓力，迴響影響中心代謝，葡萄糖、乙酸、乳酸等碳源的過量均能導致這種乙醯化迴響效應。
隨著翻譯後修飾蛋白質組學科技的發展，越來越多的研究證實，蛋白質醯基化水准的改變依賴於與之對應的醯基CoA濃度。微生物中不同的醯基CoA來源也不盡相同，例如，乙醯CoA和琥珀醯CoA主要來源於TCA迴圈，丙二醯CoA主要來源於乙醯CoA羧化酶催化的乙醯CoA羧化反應（脂肪酸合成的第一步反應）。囙此，乙醯化和琥珀醯化可能與能量代謝關聯，丙二醯化修飾則可能與脂肪酸代謝相關。這種推測在隨後的研究中得到證實，由葡萄糖/丙酮酸添加引起的糖酵解及TCA迴圈增强，細胞內乙醯化和琥珀醯化修飾水准也隨之提升；抑制脂肪酸合成酶的情况下，丙二醯CoA累積，細胞內蛋白質丙二醯化水准也隨之升高。此外，外源脂肪酸鹽的添加同樣會引起細胞內醯基化水准的波動，乙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽或丁酸鹽的添加均能通過新增胞內相應醯基CoA積累引起醯基化修飾水准的顯著提高。
2醯基CoA與微生物天然產物合成
微生物，是現時已知的天然產物或次級代謝產物合成的主要底盤細胞，利用微生物生產所得的次級代謝產物例如抗生素、生物鹼、萜類、酚類等廣泛地應用於醫藥和農業為代表的多種產業中。葡萄糖、脂肪酸、胺基酸等營養物質的基礎代謝為次級代謝產物合成提供所需的各種醯基CoA類前體和輔因數，這些前體物質的供給充足是產物合成的先决和保障，前體物質的供應能力也在一定程度上决定和制約著產物的合成能力。
2.1醯基CoA積累促進產物合成
乙醯CoA不僅是TCA迴圈的必需組分，也是細胞內脂質、胺基酸和次級代謝產物合成的重要前體，乙醯CoA還能通過各種途徑轉化生成其他醯基CoA，用於更多代謝產物如聚酮類、芪類、黃酮類、生物能源類及生物資料等物質的合成。聚酮類化合物具有多樣的分子結構、功能和生物活性，比如抗細菌（紅黴素、四環素）、抗真菌（灰黃黴素、兩性黴素）、抗寄生蟲（阿維菌素、奈馬克丁）、抗癌（多柔比星）以及免疫抑制（雷帕黴素）等。聚酮類物質的合成與脂肪酸合成類似，是一種鏈延伸式的合成管道：在聚酮合酶（PKSs）的催化作用下，以醯基CoA為起始單元，不同類型的其他醯基CoA（如乙醯CoA、丙醯CoA、丙二醯CoA、甲基丙二醯CoA等）為延伸單元，重複脫羧縮合形成聚酮鏈環。例如，紅黴糖多孢菌的紅黴素合成，一個起始單元丙醯CoA和六個延伸單元甲基丙二醯CoA由多個PKSs催化縮合形成紅黴素的主環6-脫氧紅黴內酯B（6-dEB）；抗生素鏈黴菌的竹桃黴素合成，以乙醯CoA為起始單元，6個甲基丙二醯CoA為延伸單元；委內瑞拉鏈黴菌的酒黴素合成，以丙醯CoA為起始單元，1個丙二醯CoA和4個甲基丙二醯CoA為延伸單元；諾爾斯鏈黴菌的制黴菌素合成，以乙醯CoA為起始單元，3個甲基丙二醯CoA及15個丙二醯CoA為延伸單元等。植物合成的芪類和黃酮類化合物（例如赤松素和白藜蘆醇），是由植物特有的PKSⅢ催化丙二醯CoA合成，在微生物中通過合成生物學方法設計合成途徑，异源表達PKSⅢ，也能實現這類物質的高效合成。生物能源類物質（如丁醇、長鏈脂肪醇、脂肪酸及烷烴等），多以乙醯CoA、丙二醯CoA及其他醯基CoA為合成前體。聚羥基脂肪酸酯（PHA）由乙醯CoA及各種羥基脂醯CoA聚合而成，是一種具有良好的生物相容性、生物可降解性和熱加工效能的天然高分子生物資料。
通過代謝工程及合成生物學手段强化醯基CoA前體的供應，是提高產物合成效率的常用策略。例如，在黃酮類物質的生物合成中，通過過表達异源乙醯CoA羧化酶和敲除醯基CoA：甘油二酯醯基轉移酶的管道，優化丙二醯CoA合成途徑，增强丙二醯CoA供應，顯著促進泥質鏈黴菌中光神黴素合成。在委內瑞拉鏈黴菌中，敲除前體（2S）-丙二酸乙酯醯CoA代謝相關基因meaA，共表達泰樂菌素聚酮合酶與途徑特异型調控因數PikD，增强前體供應，使泰樂酮產量提高了10倍。在紅黴素的工業生產中，利用適量濃度正丙醇的添加，增强丙醯CoA供應，啟動丙醯CoA羧化酶，加速甲基丙二醯CoA的轉化率，可提高紅黴素的產量；通過敲除丙醯CoA羧化酶的負調控蛋白PccD，提高丙醯CoA的同化效率和甲基丙二醯CoA供應，實現了紅黴素產量的翻倍。在天藍色鏈黴菌中，敲除G6P脫氫酶和過表達乙醯CoA羧化酶，增强丙二醯CoA的供應，最終使放線菌素的產量提高了近5倍。
在芪類物質的合成中，通過新增丙二醯CoA供應，同樣可以實現白藜蘆醇和赤松素生物合成的顯著提高。在倍半萜青蒿素的前體紫穗槐二烯的生物合成中，通過過表達乙醛脫氫酶和乙醯CoA合成酶，增强乙醯CoA代謝流，使得紫穗槐二烯產量提高了一倍。通過重塑中心代謝的管道，提高胞內乙醯CoA供應，實現倍半萜烯類化合物法呢烯（β-farnesene）發酵組織達130g/L。在生物能源類物質的生物合成中，提高乙醯CoA供應，可使正丁醇產量提升2倍，在此基礎上繼續敲除乙醇脫氫酶ADH1-5和過表達乙醛脫氫酶突變體adeEA267T/E568K，强化乙醯CoA供應，正丁醇產量進一步新增了40%。
除了提高前體醯基CoA的供應之外，消除與產物合成無關的醯基CoA消耗也是强化前體供應的有效手段。以常用的底盤細胞大腸桿菌為例，高速生長期代謝溢出產生的乙酸是有氧發酵的主要副產物，乙酸積累對細胞生長和產物合成都有負面影響，是一種碳源的損耗。囙此，針對這種碳源損耗的代謝工程改造有利於提高產物的合成。
乙酸主要來源於兩個途徑：磷酸轉乙醯基酶/乙酸激酶（Pta/AckA）途徑和丙酮酸氧化酶（PoxB）途徑。在大腸桿菌中，敲除pta能够有效减少乙酸生成，同時新增產物白介素-2和脂肪酶的合成；敲除pta同樣能使脂肪酸產量提高20%；同時敲除pta和ackA可使乙酸異戊酯產量新增一倍，在此基礎上繼續敲除poxB雖然能進一步降低乙酸生成，但產物產量卻沒有隨之新增。在真氧產堿杆菌和棕色固氮菌中採用相同的策略，同樣實現聚羥基丁酸酯（PHB）產量提高2.5倍。Mccleary等認為，敲除Pta/AckA途徑能有效减少乙酸的生成，但也會造成ATP和AcP合成受限，可能在一定程度上影響細胞的生長代謝。對此，Kim等採用反義RNA科技降低Pta/AckA表達水准，也可實現產物產量2倍的增長。
為了實現產物合成的最優化，除了針對Pta/AckA途徑和PoxB途徑的敲除/敲低之外，也需要配合其他競爭途徑關鍵酶的敲除改造。例如，組合敲除ackA、乳酸脫氫酶和富馬酸還原酶，可使乙醇產量提高2倍；組合敲除乳酸脫氫酶、乙醇脫氫酶和富馬酸還原酶，可使正丁醇產量提高1倍；組合敲除pta、富馬酸還原酶、乳酸脫氫酶和乙醇脫氫酶，結合培養條件的優化，可使丁酸鹽終產量提高近10倍。
2.2醯基CoA積累誘發醯基化抑制效應
外源性或內源性因素引起的細胞內醯基CoA波動是翻譯後修飾調控系統啟動的“開關”。胞內醯基CoA的累積誘發產物合成相關代謝途徑大量代謝酶和調控蛋白的醯基化，抑制終產物合成，這種翻譯後修飾引發的迴響調控主要表現在兩個層面：轉錄層面調控和翻譯後修飾層面調控。
轉錄層面的調控主要通過調節相關轉錄調控因數的醯基化水准實現。微生物的生長過程往往伴隨著碳、氮、磷等營養物質的供給波動，由不同轉錄因數介導的轉錄調控能够消除營養物質劇烈波動引起的代謝紊亂，以及由此產生的對細胞生長、分化、繁殖和次級代謝產物合成的不良影響。大量的研究發現，胞內許多轉錄調控因數是醯基化的修飾底物，其修飾位點多位於DNA結合結構域，通過改變賴氨酸的電荷，抑制與DNA的結合活性的管道影響靶基因的轉錄。例如，類球紅細菌中氧敏調控因數FnrL的乙醯化抑制其與靶標DNA的相互作用；沙門氏菌中亮氨酸響應調控因數Lrp的乙醯化導致其DNA結合活性的顯著降低，毒力調控因數PhoP的乙醯化能降低其毒性，毒力調控因數HilD的乙醯化能增强其穩定性；天藍色鏈黴菌中氮調控因數GlnR的多位點乙醯化顯著抑制其DNA結合能力和協同調控能力；紅黴糖多孢菌中磷調控因數PhoP的丙醯化强烈抑制其PHO結構域的DNA結合活性，削弱對靶基因的調控能力。微生物的生長和次級代謝產物合成過程並非依賴某一調控因數的單線調控，而是涉及更為複雜的包括全域調控因數和特异性調控因數在內的多線互動調控，這些調控因數的醯基化修飾，在影響靶基因轉錄的同時，也可能對初級代謝和次級代謝產生其他重要的影響。
翻譯後修飾層面的調控則是通過醯基化醯基CoA合成的催化酶，調節其酶活性實現。雖然不同醯基CoA的來源有所不同，但是內/外源的脂肪酸同化是其共通的來源途徑。微生物細胞脂肪酸的同化途徑有三種：醯基CoA合成酶途徑，醯基AcP合成酶途徑和脂肪酸激酶途徑。其中，醯基CoA合成酶途徑的催化酶是最為典型的醯基化修飾底物。以乙醯CoA合成酶（Acs）為例，其活性受到關鍵位點的可逆乙醯化調控，乙醯化能够直接抑制有機酸的腺苷化和乙醯CoA的合成，已有的研究報導涉及大腸桿菌、假單胞菌、枯草芽孢杆菌、鏈黴菌和分枝杆菌等多種微生物。除了Acs以外，其他醯基CoA合成酶也存在類似的翻譯後修飾調控，醯基CoA合成酶的活性對於細胞生長和次級代謝產物合成尤為重要，其活性异常不僅會導致醯基CoA供應异常、胞內能量失衡、嚴重時甚至還會引發細胞的生長缺陷。
醯基化修飾對代謝酶或調控因數轉錄水准和翻譯後修飾水准的雙層調控會直接影響醯基CoA類前體的有效供應和次級代謝產物的合成。例如，以丙醯CoA為前體的紅黴素合成途徑中，外源添加正丙醇或丙酸鹽會誘發全域調控因數PhoP以及紅黴素合成途徑催化酶丙二酸半醛脫氫酶、丙醛脫氫酶、SAM合成酶和丙醯CoA合成酶的丙醯化，抑制紅黴素合成基因簇的轉錄、前體丙醯CoA的利用和紅黴素合成；以丙二醯CoA為前體的十一烷基靈菌紅素生物合成中，丙二酸鹽添加引起高水准的蛋白質丙二醯化，抑制產物的合成；以丁醯CoA為前體的丁醇合成過程中，丁醇合成途徑代謝酶的丁醯化也抑制了終產物的合成；在人工構建的大腸桿菌細胞工廠用於赤松素的合成過程中，同樣存在由於產物合成途徑催化酶（對香豆酸連接酶和芪合成酶）的丙二醯化抑制了催化活性，從而導致赤松素的產率下降。
綜上所述，醯基CoA積累對合成代謝具有雙重效應：一方面，前體供應的新增，能够促進生物合成效率；另一方面，醯基化供體的新增，會造成合成代謝途徑相關酶的醯基化水准提高，抑制代謝酶催化活性及產物合成效率。囙此，解析醯基CoA“雙重身份”——醯基化供體及代謝前體之間的相互影響與平衡，揭示醯基化修飾對合成代謝酶活性的調控機制，從醯基CoA平衡及蛋白質翻譯後修飾角度研究微生物（內源或外源）合成途徑與底盤細胞自身代謝網路的互作機制，協調合成途徑各元件之間、合成途徑與底盤細胞之間的適配性等是微生物合成體系設計與優化需要解决的共性科學問題（圖2）。
圖2醯基CoA積累對合成代謝的雙重效應
3翻譯後修飾代謝工程策略及應用
醯基CoA的代謝樞紐地位，以及在基礎營養代謝和合成代謝之間“承上啟下”的角色，推動了一系列圍繞醯基CoA展開的代謝工程和生物合成設計與改造工作。以工程策略側重點的不同，分為傳統的“開源節流型”——新增前體供應的同時消除競爭途徑的消耗，和新型的“平衡型”——翻譯後修飾代謝工程改造策略。
翻譯後修飾代謝工程（PTM-ME）是2018年由我國科學家提出的一種新型的微生物合成代謝優化設計策略，與傳統策略所不同的是，該策略集合了傳統策略“開源節流”的優點，取長補短，從醯基CoA平衡及蛋白質翻譯後修飾角度分析微生物內源性或嵌入性工程化設計生物合成體系與細胞整體代謝網路之間的互作機制，通過調節和優化代謝酶/醯基化系統，提高合成代謝途徑代謝流以及與底盤細胞的適配性（圖3）。該策略的基本路線是：解析醯基化代謝的調控機制→篩選產物迴響抑制的關鍵靶點→代謝酶醯基化的脫敏改造或醯基化系統的優化改造，消除迴響抑制，强化產物合成。現時，PTM-ME策略已成功應用於聚酮化合物（紅黴素）、生物能源類物質（丁醇）以及芪類化合物（赤松素）的高效合成。
圖3翻譯後修飾代謝工程策略原理示意圖
3.1 PTM-ME應用於紅黴素的高效合成
紅黴素是醫藥和畜牧業中常用的大環內酯類抗生素。在紅黴素的發酵生產過程中，研究者發現蛋白質丙二醯化和丙醯化會影響菌體生長及紅黴素的合成，且胞內丙二醯化/丙醯化水准與產物合成效率呈負相關。紅黴素合成前體丙二醯CoA/丙醯CoA的適量供應有利於產物合成，當前體丙二醯CoA/丙醯CoA積累過量時，又會產生醯基化效應，抑制產物合成。Xu等運用丙二醯化修飾組學科技，從132個蛋白上共鑒定到192個丙二醯化修飾位點，結合生物資訊學分析發現丙二醯化修飾蛋白在核糖體及中心代謝途徑中顯著富集，其中，乙醯CoA合成酶（Acs）和穀氨醯胺合成酶的活性受到丙二醯化的顯著抑制。由於正丙醇或丙酸鹽添加是提高紅黴素發酵組織的常用手段，研究者隨後對丙醯化組學的研究證實，醯基CoA濃度的動態改變會引起蛋白質醯基化水准與紅黴素產量隨之改變的連鎖反應。利用定量醯基化組學科技，酶學特徵分析和醯基化類比分析，研究者確定了丙醯化修飾是影響紅黴素產量的關鍵修飾，從兩個層面負調控紅黴素的合成：一是通過抑制丙二酸半醛脫氫酶（MmsA2）、丙醛脫氫酶（Adh）、SAM合成酶（SAMS）和丙醯CoA合成酶（PrpE）的活性阻礙丙醯CoA的合成；二是通過對全域調控因數PhoP的抑制，降低其PHO結構域的DNA結合活性，削弱靶基因紅黴素合成基因簇的轉錄以及細胞對碳源的利用。在此基礎上，研究者利用PTM-ME策略，對醯基化酶和醯基化修飾系統分別進行了脫敏和優化改造。通過敲除丙醯轉移酶（GNAT）、過表達去丙醯化酶（SrtN）和醯基化不敏感酶（SACE_1780）等管道，消除丙醯化對紅黴素合成的抑制作用，最終實現工業高產菌中紅黴素的產量翻番（圖4）。
圖4 PTM-ME應用於紅黴素的高效合成示意圖
3.2 PTM-ME應用於丁醇的高效合成
在生物能源類物質丁醇的生物合成中，丙酮丁醇梭菌由產酸期到產醇期的過渡伴隨著由生長狀態到孢子狀態的轉變，以及胞內AcP和丁醯磷酸（BuP）含量的升高，從而導致對數中後期胞內乙醯化和丁醯化水准的升高。研究者通過定量醯基化組學分析，一共鑒定到458個乙醯化位點和1109個丁醯化位點，顯著富集於丁醇合成相關的丙酮酸途徑、丁酸鹽途徑和丁醯CoA合成途徑。結合深入的分析挖掘，篩選出了由於活性受到乙醯化/丁醯化抑制而影響菌體產醇的代謝酶，包括醇/醛脫氫酶AdhE1、丁醛脫氫酶BdhA、乙醯CoA醯基轉移酶（CA_C2873）、3-羥基丁醯CoA脫氫酶（Hbd）、3-羥基丁醯CoA脫氫酶（Crt）、丁基CoA脫氫酶（Bcd）等。利用PTM-ME策略對這些代謝酶的進行改造，也能够一定程度上消除丁醯化的迴響抑制，提高丁醇產量（本文作者團隊未發表的數據）。
3.3 PTM-ME應用於大腸桿菌人工合成赤松素的高效合成
PTM-ME除了能應用於內源性生物合成途徑的優化改造，對於嵌入型生物合成途徑的優化及其與底盤細胞適配性的調節同樣適用。以赤松素為例，研究者在底盤細胞大腸桿菌中嵌入了赤松素的3個合成元件：苯丙氨酸氨基裂解酶PAL，對香豆酸CoA連接酶4CL和芪合成酶STS。其運作原理是，PAL利用苯丙氨酸轉化生成反式-肉桂酸，經4CL催化生成反式-肉桂醯CoA，再由STS催化與三分子丙二醯CoA縮合生成終產物赤松素。
在人工構建的赤松素合成過程中，由於丙二醯CoA前體的供應是赤松素合成的限速步驟，囙此添加丙二醯CoA啟動劑淺藍黴素，能有效提高丙二醯CoA前體的供應和赤松素產量。在隨後的淺藍黴素添加過程中，研究者再次發現了由於醯基化抑制導致的產物合成下降的現象，過量的淺藍黴素添加誘發了三個合成元件催化酶的丙二醯化修飾，通過抑制4CL和STS的活性，阻礙赤松素的合成。對此，研究者利用PTM-ME策略，對醯基化敏感的4CL和STS丙二醯化位點進行改造，採取將賴氨酸替換為精氨酸的管道，將其改變為對醯基化不敏感的狀態，在一定程度上消除了醯基化抑制效應，使得赤松素產量提高了近兩倍（圖5）。這些研究表明，PTM-ME策略對於解除內源性及外源性產物合成途徑中醯基CoA誘發的醯基化迴響抑制、强化產物合成，都具有十分可觀的成效。
圖5 PTM-ME應用於赤松素的高效合成示意圖
4總結與展望
基因工程技術和模塊元件設計與構建方法的不斷進步，加速了以產物合成最優化為導向的“量身定做”型合成生物學的發展行程。但是，構建標準、高效、可控的微生物細胞工廠仍然面臨嚴峻挑戰，究其根本，微生物底盤細胞自身的代謝網路與產物合成途徑/嵌入式產物合成途徑的相容性一直是亟待解决的覈心問題。
雖然已有的代謝工程策略從多個角度，提高前體供應，阻斷競爭旁路，盡最大可能實現產物合成通路代謝流的最優化，但是不得否認的是，產量瓶頸極大地阻礙了微生物細胞工廠的開發潛力。尋求產量的突破，從合成生物學的角度來說，“平衡”是不容忽視的，在產物合成途徑中前體醯基CoA的供應一旦超過了底盤細胞利用極限，就會觸發醯基化效應，也可以理解為醯基化作為一種臨時的碳源存儲，緩解了碳源過量對細胞的傷害，這也是產物合成途徑與底盤細胞“失配性”的體現。如何解决“失配性”向“適配性”的轉變，讓細胞維持最小的生長所需，實現最大的產物合成，就必須要考慮醯基化修飾對基礎代謝和合成代謝的迴響作用。
微生物代謝調控網絡極其複雜，內源性或嵌入的工程化設計生物合成體系與細胞整體代謝網路存在多方面多層次交叉互作，PTM-ME策略正是在增强前體供應代謝工程和消除競爭途徑代謝工程的基礎上，引入了平衡前體供應和前體利用的理念，以微生物醯基化修飾調控機制為指導，設計針對醯基化修飾的改造靶點，减少醯基化修飾引起的碳損耗及碳流抑制，提高產物合成效率。如果把整個生物合成系統比作一臺“電腦”，那麼PTM-ME的角色就是“散熱器”，緩解超載運行的熱量堆積，保障“CPU”的高速運作。囙此，PTM-ME策略不應僅僅局限於代謝工程設計，也可嘗試拓展應用於元件工程、線路工程、基因組與細胞工程等領域的設計，促進蛋白質翻譯後修飾線路在生物技術領域的推廣。雖然PTM-ME科技現處於初級階段，但可以預見的是，若與其他工程策略的聯手組合，結合最新的基因編輯等優質科技，定能實現“1+1>2”的功效，賦予細胞更大更强的產能。我們相信，在不久的將來，翻譯後修飾代謝工程及其優化策略能够在智慧人工合成途徑與底盤細胞的設計、組裝、優化以及工業化方面做出重要貢獻。
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