南京大學生科院李根喜教授課題組在新冠肺炎病毒檢測新方法研究方面取得多項成果

疫情出現以後,借助當今先進的生物技術及醫學診斷科技,國內外臨床檢驗工作者迅速製定了新冠肺炎病毒檢測方案,為有效抗擊疫情創造了條件。與其同時,相關領域基礎研究的學者紛紛開展了相關研究,以便為新冠肺炎病毒檢測方法提供技術支援。

新型冠狀病毒肺炎疫情,簡稱新冠肺炎疫情,由嚴重急性呼吸綜合征-冠狀病毒2(SARS-CoV-2)感染而引發。疫情出現以後,借助當今先進的生物技術及醫學診斷科技,國內外臨床檢驗工作者迅速製定了新冠肺炎病毒檢測方案,為有效抗擊疫情創造了條件。與其同時,相關領域基礎研究的學者紛紛開展了相關研究,以便為新冠肺炎病毒檢測方法提供技術支援。

南京大學生命科學學院李根喜教授課題組長期從事生物分子工程及臨床檢測應用方面的研究工作,在基於生物傳感的分子診斷科技研究方面取得了系列研究成果。新冠肺炎疫情出現以後,李根喜教授課題組及時調整研究工作重心,在我校專項資金的支持下,與南京市第二醫院(南京市新冠肺炎患者定點收治醫院)易永祥院長、檢驗科李金龍副主任等專家合作,致力於研發基於生物傳感技術的低成本、便捷式新冠肺炎病毒檢測新方法,並且取得了多項研究成果。

(1)研發了一種基於共價有機框架膠囊視覺化檢測SARS-CoV-2 RNA的方法。對於新冠肺炎這樣的惡性傳染性疾病,“床邊檢測科技”,也就是僅需小型、甚至無需檢驗設備即可居家進行檢測的科技尤為重要。為此,李根喜教授課題組基於共價有機框架膠囊提出了視覺化檢測SARS-CoV-2 RNA的新方法。共價有機框架(Covalent organic frameworks,COFs)由於其結構和功能的多樣性,近年來受到了研究人員的廣泛關注,它們獨特的理化性質使其在生物傳感領域展示出巨大的應用潜力。李根喜教授課題組設計了一種新穎且簡便的策略來製備共價有機框架膠囊,並開發了一種新型的比色測定法將該膠囊用於SARS-CoV-2 RNA的視覺化檢測。他們採用可降解的一種金屬有機框架資料(MOFs)ZIF-90作為犧牲範本來製備空心的COF膠囊,用於封裝辣根過氧化物酶(HRP),所製備的COF膠囊可為酶分子提供合適的微環境,改善酶的構象自由度,增强傳質能力,並賦予酶較高的環境耐受性。值得注意的是,包裹在COF膠囊中的酶具有顯著的穩定性和可重複使用性,該方法結合了COFs和MOFs兩種納米材料的優勢,為提高酶的效能開創了一種的新途徑。通過這種設計,他們所提出的方法對於SARS-CoV-2 RNA的檢測表現出卓越的分析效能。如圖1所示,檢測限低至1.65pM,單堿基錯配也可被檢出,使用該方法分析臨床樣本,可以成功區分出新冠肺炎患者與健康人群,顯示出廣闊的應用前景。這一工作已發表在國際著名學術期刊Chem.Eng. J.(IF: 13.273),論文連結https://authors.elsevier.com/sd/article/S1385-8947(21)03911-5,我校博士研究生王明慧同學為論文第一作者,李根喜教授、楊潔教授與南京市第二醫院檢驗科李金龍副主任為共同通訊作者。

圖1.該視覺化分析方法的檢測效能

(2)研製了一種靈敏檢測SARS-CoV-2 RNA的電化學生物感測器。電化學生物感測器具有設備簡單、操作簡便、價格低廉等優勢,例如糖尿病人廣泛使用的血糖儀就是第一代的電化學生物感測器。現時,新冠肺炎患者篩查主要依賴於實时逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。但是,這種診斷手段存在一些科技缺陷如處理時間長、涉及專用儀器,難以克服的假陰性等,囙此需要進一步開發更加簡便、可靠的診斷系統,以對可疑患者進行全面篩查。電化學生物感測器被認為是最强大的替代工具之一。基於此,李根喜教授課題組通過結合催化髮夾自組裝(CHA)和末端脫氧核糖基轉移酶(TdT)的訊號放大功能,構建了一種電化學生物感測器用於SARS-CoV-2 RNA檢測。如圖2所示,在他們的設計中,SARS-CoV-2 RNA序列的存在可以觸發CHA生成雙鏈產物,並伴隨SARS-CoV-2 RNA的迴圈。然後,雙鏈產物將與在電極表面修飾的DNA髮夾結構雜交,並形成具有三個突出的3'端的Y形結構DNA,該結構可通過TdT酶進行延伸以形成長的單鏈DNA產物。囙此,在添加Ru(NH3)63+之後,產生了顯著增强的訊號,用於SARS-CoV-2 RNA的靈敏定量。除了具有訊號高和抗干擾能力强的優點外,他們所構建的電化學生物感測器可應用於臨床樣本中的檢測,證明了其巨大臨床應用潜力。這一工作發表在國際著名學術期刊Biosensors & Bioelectronics(IF: 10.618),論文連結https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113309,我校博士研究生彭英同學為論文第一作者,李根喜教授和南京市第二醫院易永祥院長為共同通訊作者。

圖2.用於檢測SARS-CoV-2 RNA的電化學生物感測器的原理

(3)建立了一種基於檢測刺突蛋白的SARS-CoV-2分析方法。新冠肺炎疫情出現以後,結構生物學家很快解析出了新冠病毒顆粒的結構,為新藥研發打下了基礎,也為病毒檢測新方法的建立創造了條件。另一方面,醫學檢驗、尤其是對於經常需要大規模篩查的疫情防控,需要盡可能降低成本。囙此,李根喜教授課題組借助核酸適配體功能化納米通道建立了SARS-CoV-2分析新方法。醫學檢驗往往需要抗體,價格較貴,為此他們與中國科技大學羅昭峰團隊合作,由中國科大的同行篩選到與SARS-CoV-2刺突蛋白S1具有高親和力的核酸適配體,在此基礎上,受SARS-CoV-2刺突蛋白與其受體人血管緊張素轉換酶II(ACE2)在S1亞基上的一個區域結合的啟發,他們通過修飾在陽極氧化鋁膜上的適配體結合病毒的刺突蛋白引起空間比特阻及電性的變化從而改變離子電流,進而實現了對S1蛋白的生物傳感。該方法無需酶和其他試劑的加入,靈敏度高且費用低廉,對SARS-CoV-2 S1蛋白的檢測限為1fM,用於臨床咽拭子標本中病毒顆粒的檢測,效果明顯,有潜力被開發為診斷新冠肺炎患者的新工具。這一工作正在發表之中,我校博士研究生石榴同學為論文第一作者,李根喜教授與中國科技大學羅昭峰教授、南京市第二醫院檢驗科李金龍副主任為共同通訊作者。

總之,為了儘快完成新冠肺炎的病例確診和高危人群排查,發展快速、便捷、廉價的現場檢測科技是重中之重。然而,現有的病毒檢測手段成本高、檢測時間長、操作步驟繁瑣,而且需要專業人員操作,因而不能很好地滿足疫情大規模爆發時對診斷排查的需求。近年來,新型核酸擴增科技、生物傳感技術和奈米科技的發展為分子診斷科技開闢了新局面,使高效、便捷、靈敏的分子診斷方法成為可能。期望相關基礎研究能够為新冠肺炎疫情防控提供更好的技術支援。

本文標題: 南京大學生科院李根喜教授課題組在新冠肺炎病毒檢測新方法研究方面取得多項成果
永久網址: https://www.laoziliao.net/doc/1656045111446316
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