前言
血腦屏障（BBB）是中樞神經系統藥物進入大腦發揮藥效的主要障礙。如何提高小分子藥物的血腦屏障透過能力一直是藥物研究的主要內容之一。2021年9月中國藥科大學的孫昊鵬教授等在JMC上發表綜述，總結了近五年來通過結構修飾以提高小分子藥物血腦屏障穿透能力的策略，希望在未來的中樞神經系統（CNS）小分子藥物開發中發揮更大的作用。
介紹
中樞神經系統疾病（如阿爾茲海默症，帕金森病，腦卒中和腦癌等）是全球引起死亡的第二大疾病，嚴重危害人類健康。中樞神經系統疾病的治療藥物需要進入大腦發揮作用，但血腦屏障（Blood–Brain Barrier，BBB）的存在限制了藥物的通過，成為中樞神經系統藥物治療的瓶頸。
血腦屏障是介於血液和腦組織之間的天然屏障，由腦微血管內皮細胞（Brain Microvascular Endothelial Cells，BMECs）、周細胞和星形膠質細胞終足組成。內皮細胞之間形成緊密連接，幾乎只有小的親脂分子能以被動擴散的管道進入。除了被動擴散之外，大腦和外界物質交換的常見機制還有主動轉運、外排轉運和載體介導的轉胞吞作用（Carrier-Mediated Transcytosis，CMT）等。
血腦屏障對維持腦內微環境穩態至關重要，封锁親水物質、帶電分子、蛋白質和多肽進入大腦，在人體內起到保護作用，但同時也有效阻擋了超過98%的小分子藥物以及幾乎100%的大分子藥物（如重組蛋白和單克隆抗躰），使它們的腦內暴露量不足，從而限制了藥效。
評估血腦屏障滲透的參數和工具
為了更好指導CNS藥物設計，科學家開發了許多方法用來評估小分子的BBB滲透能力。
基於理化性質的電腦類比
Lipinski’s五原則是基於理化性質評估化合物成藥性的重要理論，同樣適用於CNS藥物的設計過程。基於大量實驗經驗，科學家提出來各種參數的參攷範圍。
2010年輝瑞科學家開發了結合以上六個理化參數的多參數優化算灋（MPO）以通過電腦類比方法預測化合物的BBB滲透性。CNS MPO能够平衡多種可變參數，同時擴展CNS藥物的設計空間且考慮了ADME（吸收、分佈、代謝、排泄）對BBB滲透性的影響，此外科學家也開發出了許多其他的評估算灋。所有算灋的評估結果只能作為參攷，具體的BBB滲透性還需要進一步的實驗驗證。
體外BBB滲透性預測方法
與電腦類比相比，體外預測方法是相對準確的，而相比於體內實驗，體外預測方法則更加方便。囙此，體外預測方法常用於高通量篩選中以預測分子的BBB滲透性。
平行人造膜通透性分析（PAMPA）是一個研究被動吸收的滲透模型，常用於藥物通過各種生物膜系統的評估，被測化合物從供槽通過單層生物膜擴散進入接收槽。人工膜通常來自包含特异性磷脂的豬腦以類比BBB，通常以市售藥物的值作為參攷，以驗證線性相關。以有效滲透率（Pe）表示化合物的滲透性。該法使用的人工膜並非雙層膜結構且缺少轉運體以至於不能反映外排和CMT情况，導致量測結果與實際情況參數偏差。
基於細胞的單層轉運分析使用來自細胞的極性單層膜構建體外BBB模型，包括非腦源性的MDCK細胞、Caco-2細胞、永生化腦內皮細胞系RBE4細胞等。MDCK-MDR1和MDCK-BCRP是兩個被廣泛用於藥物發現中評估轉運體介導的外排情况的細胞系。P-gp（MDR1）和BCRP是大量表達於BBB的兩個藥物外排轉運體，外排率（ER）是影響藥物BBB滲透性的重要參數。將細胞種於96孔跨孔板（96-well transwell plates）中、在一定的高密度下形成極性單層膜，可以測定化合物從頂層轉運到基底外（A-B）和從基底外轉運到頂層（B-A）的轉運情况。從頂層到基底外的樣品被收集並且通過LC-MS分析，計算錶觀滲透係數（Papp）和ER。大多數的CNS藥物具有很高的被動滲透性，Papp>15x10-6cm/s，當ER<2.5時表明化合物不是P-gp或者BCRP的外排底物。
體內實驗測定腦內藥物比率
體內評估方法具有更好的準確性和可靠性。通常使用的方法包括測定Cbrain/Cplasma參數、微透析、腦暴露評估（BEA）等方法。
Cbrain/Cplasma是廣泛用於評估腦分佈的參數，其值低於0.1則表明化合物不能自由透過BBB。未結合藥物濃度（Cu）被認為是大腦藥物發揮活性的主要部分，未結合分數（fu）是組織中可利用的游離藥物比例。血漿中未結合藥物濃度（Cu，p）=血漿中總藥物濃度（Cp）x fu，p；腦中未結合藥物濃度（Cu，b）=腦中總藥物濃度（Cb）x fu，b。相應的腦-血漿未結合藥物分配比（Kp，uu=AUCu，b/AUCu，p）是一個新的評估參數。Kp，uu為0.3作為一個區分腦滲透或非腦滲透臨界值。微透析是一個方便量測Cu，b的方法，BEA則是以Kp，uu作為參數。
新增血腦屏障通透性或降低外排率的策略
在過去的五年中，提高CNS通透性最有效的策略依然是通過結構修飾來調整被動擴散。理化性質是决定血腦屏障穿透的關鍵因素。近年來的結構修飾大多基於多個參數的優化，這樣在保持原有的活性的同時也能考慮到血腦屏障穿透性和成藥性。
大多數情况下，血腦屏障的穿透取決於化合物的親脂性，但由於通過血腦屏障存在多種藥物轉運機制，許多藥物的親脂性和藥物的大腦暴露之間通常會出現偏差。由於血腦屏障的主動外排機制，許多高親脂性藥物在腦內的濃度很低。多藥耐藥蛋白1（Multiple Drug Resistance 1，MDR1），也稱P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）轉運體和乳腺癌耐藥蛋白（BreastCancer Resistance Protein，BCRP）轉運體都是中樞神經系統中重要的藥物外排轉運蛋白。其中研究最深入的轉運蛋白是P-gp，它在血腦屏障中高度表達，這也是許多藥物不能進入大腦的原因。P-gp底物的結合傾向與化合物的理化性質相關。消除氫鍵供體、减小分子尺寸、减少電負性原子（如用S或CH2取代O）以及進行構象限制等都可以用來優化P-gp的抑制劑。
新增親脂性
親脂性定義為非離子化化合物在兩個不混溶相（如正辛醇和水/緩衝液）中的平衡分配係數，是化合物最重要的理化性質之一。親脂性影響化合物的吸收、分佈、代謝、排泄、毒性以及藥理活性等，也是一個與血腦屏障穿透性密切相關的參數。通過改善親脂性，可以增强藥物的血腦屏障穿透。在結構優化中，常用的方法是引入氟原子。氟在特定情况下的應用可以增强親脂性，同時通過佔據氧化代謝的位點提高代謝穩定性。此外，由於氟的體積小，很容易併入結構中，一般不會破壞化合物的空間構象。
間變性淋巴瘤激酶（Anaplastic Lymphoma Kinase，ALK）是治療具有ALK基因融合或啟動突變體癌症的重要靶點。克唑替尼（crizotinib，1）是廣泛使用的ALK抑制劑，由於不能穿過血腦屏障，對中樞神經系統癌症轉移的治療效果較差。研究人員通過引入氟乙基新增了克唑替尼的親脂性，血腦屏障通透性有所提高。注射5分鐘後，[18F]氟乙基克唑替尼（2）的%ID/cc為6.6，而限制在血管腔內的示踪劑的預期值僅為0.2%ID/g，2可能具有更好的治療潜力。
N-肉豆蔻醯基轉移酶（N-myristoyltransferase，NMT）是治療由寄生布氏錐蟲引起的人非洲錐蟲病（Human African Trypanosomiasis，HAT）的理想靶點。通過高通量篩選和結構優化獲得的化合物DDD85646（3）對NMT有較强的活性，但不能穿透血腦屏障（Kp<0.1）。研究人員發現3的大腦暴露量較低與較高的tPSA（89Å2）和較低的親脂性（cLogP=1.79）有關，囙此設計合成了一系列化合物3的衍生物，旨在提高血腦屏障的穿透性，其中化合物4的tPSA和cLogP得到明顯改善。進一步改造以提高親脂性，化合物5表現出明顯的抑制活性、良好的微粒體穩定性和顯著提高的血腦屏障穿透性。
减少氫鍵供體
Lipinski’s規則表明CNS藥物的氫鍵供體（Hydrogen Bond Donor，HBD）不超過三個。减少HBD的個數已經成為提高血腦屏障穿透最常用的藥物設計策略之一。研究人員用3-氯吡啶取代了6的5-氨基嘧啶，得到纖維母細胞生長因數（Fibroblast Growth Factor，FGF）受體調節劑7，改善了腦暴露量，降低了磷脂症的風險。7可能具有基礎的FGF生物活性，如神經保護和細胞增殖等，可進一步開發為治療神經退行性疾病的藥物。
以共晶結構為指導，研究人員探索了化合物8（一種ALK抑制劑）的氫鍵受體和氫鍵供體的去除對其血腦屏障通透性的影響（這些氫鍵供體或受體沒有與ALK活性位點形成必要的相互作用）。去除其中一個HBD得到的化合物9顯著抑制MDR1外排，大腦暴露有很大改善。當甲基遮罩了嗎啡啉環上的氧原子時，MDR1的外排比進一步降低。化合物10可以作為一種體內工具來闡明ALK在認知障礙、焦慮和抑鬱等中樞神經系統疾病中的作用。
當分子結構中的HBD是維持生物活性所必須時，可以考慮構建分子內氫鍵來提高血腦屏障通透性。化合物13具有中等的血腦屏障穿透水准，轉換酚羥基的位置，使極性的羥基和叔胺基團之間形成分子內氫鍵，腦滲透性得到提高。化合物11和12具有抑制Aβ42纖維性顫動的生物活性和良好的膜通透性，有望成為治療AD的多功能藥物。
反之，新增HBD的數量可能有助於開發具有外周選擇性的藥物。KCNA5（KV1.5）基因編碼的IKur在心房複極中起重要作用。化合物14有效阻滯IKur電流，是一種安全性良好的維持正常竇性心律的藥物。然而，高度的腦暴露量使化合物14產生潜在的中樞神經系統副作用。研究人員發現，在引入氫鍵供體後，化合物15在保持IKur電流阻滯的體外活性和選擇性的同時，大腦暴露率降低。
减小tPSA
tPSA定義為分子中極性原子表面的總和，與分子中極性原子數有關，是預測分子輸運性質的重要參數之一，影響血腦屏障通透性、藥物代謝、外排等。中樞神經系統藥物tPSA值一般較低（tPSA<90Å2），降低tPSA為改善大腦暴露提供了可行性。
犬尿氨酸單加氧酶（Kynurenine Monoogenase，KMO）是治療亨廷頓病（HD）的靶點。抑制KMO有望减少HD相關的毒性代謝物3-羥基犬尿素和喹啉酸。Ro-61-8048（16）是一種腦療效較差的KMO抑制劑。可能是由tPSA較高（160Å2）導致的。化合物庫中篩選得到的化合物17具有相似的母核，顯示出較好的抑制活性和適宜的tPSA值（80.3Å2）。進一步改造得到的化合物18具有納摩爾級的活性和中度的腦暴露量。由此說明降低tPSA是提高血腦屏障穿透的有效策略。
弓形蟲組織蛋白酶L（Toxoplasma gondiicathepsinL，TgCPL）是治療寄生蟲感染的潜在靶點。先導化合物19是人組織蛋白酶L（human cathepsin L，HsCPL）的抑制劑，其tPSA值（97.6Å2）較高。研究人員試圖去除一些不關鍵的極性原子，以减少總tPSA。例如，醯胺的羰基轉換為常用的電子等排體三氟甲基，化合物20顯示出對弓形蟲的高效活性和良好的血腦屏障穿透性。
新增分子剛性
CNS藥物通常剛性較强，具有多環的體系和少量的可旋轉鍵。Ghose等人提出，分子的柔性可以用環外直鏈的數量和可旋轉鍵（Rotatable Bonds，NRB）的數量來表徵，首選範圍是2-4個環外直鏈和1-4個可旋轉鍵。幾種類藥性剛性片段應用廣泛，例如，苯並氮雜卓是許多中樞神經系統藥物（如地西泮、加蘭他明和氯卡色林）中常見的骨架。
厄洛替尼（Erlotinib，21）是第一代表皮生長因數受體（EpidermalGrowth Factor Receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑，廣泛用於治療EGFR敏感突變的晚期非小細胞肺癌患者。在近60%的膠質母細胞瘤中，表皮生長因數受體發生突變和擴增。然而，由於沒有足够的腦內暴露，幾乎所有的EGFR抑制劑都未能改善膠質母細胞瘤患者的預後。囙此，開發高血腦屏障穿透性的新型EGFR抑制劑是十分必要的。研究人員猜想厄洛替尼的大腦穿透能力差與結構中靈活的烷基醚尾部有關，導致NRB（10）較大和tPSA（75Å2）較高。閉合烷氧基鏈，形成一個1,4-二氧六環，融合到喹唑啉骨架上，得到了化合物22，NRB（2）减少，tPSA（56Å2）降低。與厄洛替尼相比，化合物22的血腦屏障穿透率提高近10倍（Kp，uu=0.491）。進一步引入鹵原子，JCN037（23）的腦暴露量進一步新增（Kp，uu=1.30），在體內和體外均顯示出有效的活性。
磷酸二酯酶4D（PDE4D）負責催化cAMP分解，這是記憶形成的關鍵步驟。抑制PDE4D已被證實有助於AD等退行性疾病的治療。在先導化合物GEBR-7b（24）與PDE4D蛋白的對接和分子動力學類比中，研究人員發現亞胺醚基團與PDE4D催化位點形成關鍵的氫鍵相互作用。試圖引入雜環降低分子的靈活性，限制其構象，得到化合物25。在藥代動力學分析中，化合物25迅速被吸收並到達大腦。與24相比，25血腦屏障穿透明顯新增。
减小pKa
减小pKa也是提高血腦屏障滲透最常用的藥物設計策略之一。pKa與ER有顯著的相關性。
β位點澱粉樣前體蛋白切割酶1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme1，BACE 1）抑制劑可以阻斷澱粉樣β多肽（amyloidβpeptides，Aβ）合成的限速步驟。Aβ積累可能與阿爾茲海默症發病有關。抑制BACE 1有延遲甚至預防AD進展的潜力。化合物26的P-gp外排水准高（在MDCK細胞中ER=52）。分析表明pKa<8的化合物不太可能是P-gp底物。化合物26的pKa為9.0。通過合理設計，降低pKa，JNJ-54861911（Atabecestat，27）活性保持不變，ER值降低，在大腦中的外排减少。
研究人員在體外評估TgCPL抑制劑28和29，以確定它們是否為P-gp的潜在底物。化合物28的高ER值解釋了其腦內的低暴露量，這可能是由於結構中鹼性胺的存在。
調控多參數
在多數情况下，改善血腦屏障的通透性不只是優化一個參數，而是綜合使用多種優化策略。有時，單個參數的變化不能滿足預期的要求，或者會導致其他重要特性的變化，如活性和藥代動力學。
LY288183542（30）是一種游離脂肪酸受體1（Free FattyAcid Receptor 1，FFAR1），也稱為G蛋白偶聯受體40（G protein-coupled receptor 40，GPR40）的激動劑，可能存在血腦屏障通透性低的問題。GPR40是治療2型糖尿病的理想靶點，可以通過葡萄糖刺激胰島素分泌和腸促胰島素分泌兩種機制來調節血糖穩態。但是GPR40也可能與鎮痛、成人神經發生和神經血管退化有關。化合物30有一定的CNS暴露量（Cbrain/Cplasma=0.14）。此外，30在體外表現出高清除率（在人肝微粒體中t1/2=18min，在小鼠肝微粒體中t1/2=2min），在體內半衰期短（t1/2=1.3h）。對多個位點進行修飾，發現羰基替換新增了tPSA，降低了LogP。高剛性螺[茚-1,4'-呱啶]環的開環增强了分子的靈活性。將氮原子引入呱啶基進一步限制了分子進入大腦。化合物31和32具有較長的半衰期和良好的激動活性，血腦屏障滲透性差，基本不會產生中樞神經系統副作用。
結構簡單的分子可能更容易通過血腦屏障。精簡化合物的部分結構可以使其分子量更小，HBD更少，tPSA更低，但也存在活性降低的風險。化合物33為μ-阿片受體（μ-opioidreceptor，MOR）/κ-阿片受體（κ-opioidreceptor，KOR）激動劑。化合物33並非嗎啡的結構類似物，可能是一種新骨架的小分子阿片受體激動劑。化合物33的一個合成中間體表現出較弱的MOR激動活性，作為先導化合物對其進行結構修飾。合成了化合物34和35，它們表現出强大的活性，EC50值為10nM。34和35的腦濃度分別約為33的5倍和8倍，這證實了簡化結構有利於CNS的分佈。
囙此，在中樞神經系統藥物的發現與設計過程中，引入額外的片段需要特別注意，比如雜原子、HBD、鹼性或大分子量的基團。VU0483253（36）是一種毒蕈堿乙醯膽鹼受體亞型5（M5）的負變構調節劑，研究人員旨在通過結構修飾改善其藥代動力學，並保持高選擇性和高CNS穿透。改造得到的化合物37消除半衰期非常短（t1/2<30分鐘），活性沒有增强，血腦屏障穿透也降低了。這可能是由於環丁基（甲基）氨基的引入，使分子量、tPSA和pKa同時新增。直接在氯的鄰比特引入一個甲基得到的VU6008667（38）在大鼠中的t1/2降低了約35倍（t1/2=2.3h），同時保持了適宜的活性和良好的中樞神經系統穿透。
利用載體介導的轉胞吞作用
一些必需的營養物質如葡萄糖和胺基酸，不能通過被動擴散通過血腦屏障，需要通過載體介導的轉胞吞作用（CMT）才能到達大腦。將藥物修飾成轉運體底物的類似結構，從而被血腦屏障上的特定轉運體識別，可以顯著改善大腦對藥物的攝取。此外，這種策略也有效地降低了迴圈中游離母體藥物的濃度，從而減輕脫靶效應。
利用載體介導的轉胞吞作用通常是通過設計前藥來實現的。前體藥物需要被轉運體識別並通過血腦屏障運輸，然後通過酶促反應釋放母體藥物。一種能將藥物傳遞到大腦的前藥應具備以下特徵。（1）具有足够的外周迴圈穩定性，使藥物在進入大腦前不被破壞；（2）該結構必須被CMT蛋白識別，從而與內源營養物質競爭；（3）可以經過特异性水解，在腦內釋放出母體藥物；（4）安全性良好。此外，應注意前藥不能影響大腦對必需營養素的攝取。
利用L型胺基酸轉運體（L-Typeamino acid transporter，LAT1）進行前藥的運輸是最常見的設計。LAT1是一種跨膜异二聚體蛋白，由於大腦需要持續的胺基酸供應，LAT1在血腦屏障、神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞中高度表達。臨床上常用的幾種胺基酸類藥物和前藥均通過LAT1轉運，如左旋多巴（L-dopa）、加巴噴丁（gabapentin）、美法侖（melphalan）等。
研究人員設計合成了環加氧酶抑制劑酮洛芬（ketoprofen）的前藥。單次腹腔注射給藥25μmol/kg後，前藥39和40能在腦內釋放適宜濃度的母體藥物，Kp，uu（分別為0.13和0.35）比酮洛芬本身（Kp，uu=0.01）高了10倍以上。
另有研究人員設計並合成了一種LAT1介導轉運的六氫煙酸前體藥物。化合物41提高了六氫煙酸的血腦屏障穿透能力，並表現出抗癲癇活性，有效地抑制了神經元和膠質γ-氨基丁酸（GABA）的攝取。六氫煙酸和41以15mg/kg劑量給藥30分鐘後，六氫煙酸組小鼠腦內未檢測到六氫煙酸，而化合物41組小鼠腦內釋放六氫煙酸的濃度為450nmol/g，大大增强了六氫煙酸的轉運。
L-抗壞血酸（L-Ascorbic acid，AA）也可以作為腦內藥物遞送的載體。大腦中有兩種轉運蛋白可以轉運AA。葡萄糖轉運體1（Glucose transporter 1，GLUT1）可以運輸AA的氧化形式，而Na+依賴的維他命C轉運體（Na+-dependent vitamin C transporter，SVCT2）則直接將AA轉運到大腦。布洛芬的前體藥物42可以通過AA相關的轉運體運輸，具有良好的血腦屏障穿透能力，攝取效率是布洛芬的3.16倍。
然而，這種策略並不都是成功的，前體藥物不穩定，在外周迴圈中分解或不能在大腦中水解成母體藥物都會導致大腦中的母藥濃度不能得到顯著增加。例如，研究人員連接阿魏酸和胺基酸殘基得到前藥43，43有效地與LAT1結合並穿過血腦屏障。然而，阿魏酸的腦暴露水准沒有明顯改善，研究人員發現，這是由於化合物43難以水解成母體藥物導致的。
囙此，另一個不同於前藥的設計理念是遞送載體結合到分子上並不影響靶點活性。這種策略的優點是不需要考慮前體藥物的穩定性和水解性。例如，研究人員合成了一個與CR-6的內源性營養物質衍生物庫，其中胺基酸衍生物44的大腦暴露量最高。44和母藥CR-6通過腹腔給藥，劑量為0.2mmol/kg，1h後，化合物44組Cbrain為15.8nmol/g，約為CR-6組大鼠的4倍。
中樞神經系統的特殊結構靶向
藥物在全身血液迴圈，並通過被動擴散或主動轉運進入大腦。然而，交換機制是雙向的，從大腦到血液的被動擴散或主動運輸同時也在進行。一些具有特殊結構的分子可以被CNS內的各種酶催化，一旦進入大腦就不能從血腦屏障運輸出去。通過這種“鎖定”功能，前藥的運輸由雙向變為單向，從而提高了大腦中活性藥物的濃度。
研究人員報導了基於多奈呱齊（Donepezil）的結構修飾前藥。引入一個1,4-二氫吡啶環取代多奈呱齊的呱啶基團，遮罩了氮上的正電荷。前藥45由於1,4-二氫吡啶氮的良好親脂性，能够穿過血腦屏障，而在生理pH下，它還不足以質子化。前藥45在人血漿中具有良好的穩定性，進入大腦後，氧化還原酶介導的氧化還原反應將前藥45轉化為相應的藥物46。46的N具有正電性，血腦屏障穿透度低，由此產生“鎖定”效應，腦內藥物濃度提高。
另有研究人員開發了一種具有“鎖定”功能的腦靶向AA前體藥物。布洛芬前體藥物由AA載體傳遞，並與二硫胺傳遞系統結合。前藥47在空氣中穩定，易於保存。一旦進入中樞神經系統，它可以被二硫還原酶還原，然後環閉合生成噻唑，化合物48不能通過血腦屏障運送到腦外。48再通過水解釋放活性藥物，發揮治療作用。
總結
長期以來，AD、PD和腦卒中等中樞神經系統疾病威脅著人類健康，給患者和社會帶來巨大影響。然而，新的中樞神經系統藥物的開發非常困難，穿透血腦屏障是開發新型中樞神經系統藥物的重大挑戰。
新增親脂性、减少氫鍵供體、减小tPSA、新增結構剛性和减小pKa都是通過改變理化性質或降低外排來提高BBB穿透水准，此外，利用載體介導的轉胞吞作用，通過一些特殊結構產生中樞神經系統“鎖定”效應也有利於增强腦滲透。有時改變一個參數並不能得到預期的結果，需要結合多種策略，以達到各方面的平衡。相信在藥物化學修飾的助力下，未來能有更多可供選擇的中樞神經系統藥物上市，為廣大的患者帶來福音。
參考文獻：
1. Baichen Xiong，Yuanyuan Wang，et al.Strategiesfor Structural Modification of Small Molecules to Improve Blood–Brain BarrierPenetration: A Recent Perspective.J. Med.Chem.2021，64，1813152–13173.
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