摘要
環脂肽化合物是一類結構新穎的環狀肽類，其兩親性的物化特性决定了其獨特的生物活性，可作為抗生素、生物表面活性劑等。在生物防治、藥物開發、環境修復和疾病治療等方面廣泛應用，具有迫切的市場需求和廣闊的發展前景。環脂肽類天然產物主要由非核糖體肽合成途徑合成，由於環脂肽合成複雜的代謝網路和前體需求、專一且嚴格的合成途徑、多種同系物的共存，制約著環脂肽合成的微生物開發和產品價值提升。本文主要介紹了來源於細菌界的環脂肽類物質的結構特性，非核糖體肽合成途徑及非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）的結構域特點，天然產物底盤菌株開發現狀，通過基因工程、代謝工程方法進行同系物調控和生物合成策略，混菌對脂肽生物合成的影響，以及合成生物學在脂肽合成中的應用。隨著合成生物技術的迅速發展和運用，環脂肽類天然產物的微生物合成也有望實現“質”和“量”的提升，以及促進新型脂肽的開發。
全文
脂肽是一類重要的由胺基酸衍生的低分子量生物表面活性劑和抗菌肽，主要通過非核糖體肽和聚酮雜合途徑生物合成。其結構中既含有親水性的胺基酸，又有疏水性脂肪酸鏈，其兩親性質對其抗菌活性至關重要。其中，胺基酸肽鏈連接成環或與部分脂肪酸鏈連接成環形成環脂肽。細菌環脂肽是由微生物產生的次級代謝產物，具有表面活性劑性質，並且針對不同細菌、真菌等病原體具有廣譜的抑菌活性。環脂肽在生物防治、微生物採油、臨床治療、環境治理等方面具有多種應用。常見的環脂肽有表面活性素（surfactin）、豐原素（fengycin）、多黏菌素（polymyxin）、達托黴素（daptomycin）、伊枯草菌素（iturin）等。近年來，包括多黏菌素和達托黴素在內的幾種環脂肽類抗生素已經獲得FDA準予用於治療多重耐藥性超級細菌感染。多黏菌素對許多耐藥細菌的治療具有有效性，多黏菌素B和E被認為是對抗耐藥細菌的“最後一道防線”，世界衛生組織將多黏菌素重新列為“至關重要的藥物”用於臨床治療。但已有研究發現多黏菌素耐受基因，在全球引起高度關注。同時，環脂肽類抗生素在生產和使用過程中面臨著一些問題：多種同系物存在導致發酵產品品質難控，多種結構複雜的類似物難預測、形成不同的生物活性，不同製造商和發酵過程的穩定性差异性大。而且環脂肽產物組分的不統一，對臨床使用造成困擾，影響藥代動力學、藥效學和毒性動力學成效等。新型環脂肽分子可能成為一類新的抗菌劑。面對越來越多耐藥病菌的出現，急需尋找新的抗生素，更好地理解抗菌肽的合成、修飾和作用機制將重啓它的商業開發。
1脂肽合成的微生物底盤
1.1主要的細菌脂肽和來源
產脂肽的微生物分支，包括芽孢杆菌屬（Bacillus）、類芽孢杆菌屬（Paenibacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鏈黴菌屬（Streptomyces）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、沙雷菌屬（Serratia）和伯克菌屬（Burkholderia）等。很多脂肽不僅能降低表面張力，而且具有顯著的生物活性，以玫瑰孢鏈黴菌（Streptomyces roseosporus）中的達托黴素和多黏芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）中的多黏菌素B為代表。脂肽一般由親水性的寡肽和疏水性的脂肪酸鏈組成，根據結構特點又可細分為環狀陽離子脂肽、環狀非陽離子脂肽、線性陽離子脂肽。主要的細菌脂肽如圖1所示。其中，環脂肽構成了結構多樣的天然產物家族，主要由鏈黴菌、芽孢杆菌和假單胞菌屬細菌生物合成。環脂肽的大部分生物活性歸因於其兩親特性，可作為理想的生物表面活性劑。囙此，許多環脂肽對於菌群運動和生物膜的形成至關重要。其表面活性劑性質被廣泛應用於石油開採、環境治理等方面。在結構上，環脂肽由一個寡肽和一個肽連接的N末端脂肪酸組成。線性或分支的脂肪醯尾巴長度（通常為C6~C18）和氧化程度可以不同。寡肽（最多25個胺基酸）的C末端與寡肽側鏈或脂質部分中存在的羥基、酚或氨基官能團形成內酯或內醯胺，從而形成大小各异的肽環（通常為4～16個胺基酸）。通過非核糖體肽合成酶（NRPS）生物合成的環脂肽，寡肽中可以存在非蛋白質（如D-構型或β-胺基酸）和修飾的胺基酸（如4-氯蘇氨酸）。除了具有生物表面活性劑的性質，環脂肽還表現出有效和具有選擇性的抗細菌、真菌和細胞毒性的作用。由Cubist公司開發的達托黴素是為數不多的新準予用於治療革蘭氏陽性細菌感染的抗生素之一。另外，某些芽孢杆菌菌株可以被用做作物保護中的生物防治劑，產生的環脂肽可以提高植物的整體適應性。
圖1部分常見的脂肽類型
近年來，海洋和沿海環境已成為發掘和獲得非核糖體肽的重要來源。Martínez-Núñez等通過轉錄組分析發現海岸沉積物中高表達NRPS的生物菌群Proteobacteria和Firmicutes，並預測和鑒定了NRPS結構域基因序列。Zhang等通過同源建模、生物資訊學分析和分子對接的方法確定了海洋Bacillus atrophaeus C89非核糖體肽合成酶合成Bacillamide C過程中兩個腺苷醯化結構域的底物特异性。天然產物生物合成的蛋白質組學策略如次生代謝蛋白質組學（PrISM）、正交活性位點識別系統（OASIS）等應用，以及基於活性NRPS蛋白質譜（ABPP）探針的開發，促進了NRPS基因簇的鑒定和結構域的功能分析。
1.2天然產物底盤菌株開發現狀
天然產物底盤菌株構建的常見方法包括基因組精簡與優化、各類調控因數的改造（轉錄調控因數，包括全域調控因數、途徑專一性調控因數等）和强化前體物供應。其中基因組精簡和優化是最主要和直接的方法。通過删除同類非目標天然產物競爭途徑中的長基因簇，以及删除基於脂肽合成模組化代謝工程中無用的代謝途徑，可以有針對性地提高目標脂肽的合成效率和質量，提高底盤的生產效能。
天然產物底盤菌株需要從生長週期、轉化效率、菌株形態、遺傳穩定性、次級代謝譜、能量和還原力、异源蛋白合成能力、次級代謝產物表達能力等方面進行系統評估。常見的脂肽合成底盤宿主包括鏈黴菌、伯克菌、芽孢杆菌等。這些菌株可以提供生物合成的前體分子，並且對各自的表面活性終產物表現出足够的耐受性。而且，由於系統發育的關係，它們在鳥嘌呤-胞嘧啶含量和密碼子使用方面具有一系列生產菌株的遺傳相容性。隨著基因測序科技的快速發展和各種基因發掘方法的建立和應用，很多天然產物包括環脂肽類物質合成基因簇被鑒定出來。但這些基因簇在天然宿主中絕大部分都是沉默的，無法實現產物的最終合成，或者可合成的天然產物產量極低，選取困難，無法實現工業化生產。運用合成生物學的方法建立高效合成脂肽類天然產物的底盤菌株，不但可以改善菌株的遺傳穩定性，提高异源表達，而且可以通過應用强度和功能已知且可控的啟動子、終止子、轉錄調控開關等各種元件對目標產物的合成基因進行調控。重構天然產物的合成途徑和基於前體物合成的代謝網路可以實現新型天然產物的開發。
鏈黴菌是最大的天然產物來源菌。Komatsu等通過簡化阿維鏈黴菌基因組，構建了通用模式底盤菌株Streptomyces avermitilis SUKA17，對包括NPRS類化合物Holomycin在內的20種不同類型的次級代謝合成基因簇進行了异源表達。Liu等删除了Streptomyces sp. FR-008三個內源性聚酮合酶（PKS）基因簇，構建出一個相對乾淨的無聚酮合成競爭的底盤宿主，為异源表達天然產物合成基因簇提供了平臺。Tan等通過轉錄調控策略在Streptomyces sp. SCSIO 02999中原位啟動了TPM A的生物合成基因簇，敲除兩個負調控基因（totR3/totR5）和超表達一個正調控基因（totR1），實現了主產物TPM A的合成和一個磺酸化的新產物TPM C的分離鑒定。為提高工程菌的遺傳穩定性，將TPM A在模式菌株S. lividans TK64中進行异源表達，結合基因調控策略，TPM A產量提高約6倍。此外，一些海洋生產菌株屬於放線菌進化枝，鏈黴菌作為最有價值的代表，適用於作為一些海洋生物表面活性劑生產的宿主系統，尤其是對NRPS衍生的化合物。
伯克菌是僅次於鏈黴菌的天然產物來源的第二大類細菌。Wang等建立了伯克菌DSM 7092基因組無痕修飾的方法，實現了對大片段基因簇的敲除，為改造伯克菌為通用底盤菌株提供了基礎。此外，Zhi等通過基因組學和轉錄組學發現解澱粉芽孢杆菌MT45擁有同類解澱粉芽孢杆菌中更小的基因組和顯著富集的表面活性素（Surfactin）合成途徑，包括中心碳代謝和脂肪酸生物合成。Wu等通過强化Bacillus subtilis 168細胞內支鏈脂肪酸合成路徑提高前體物脂肪酸的供應，使表面活性素產量提高了20.8倍。Hühner等建立釀酒酵母NRPS基因表達系統進行α-酮羧酸二聚體生物合成，為酵母底盤菌株的構建提供了借鑒。
2脂肽合成的模塊結構域特點
非核糖體肽與核糖體肽不同，複雜的蛋白結構不受特异性胺基酸序列限制，具有大量潜在而且靈活的結構多樣性。在非核糖體肽生物合成中，胺基酸通過腺苷醯化（A）結構域進行腺苷醯化，該結構域包含特异性識別元件以選擇正確的摻入基團，該基團裝載到肽基載體蛋白（PCP）上，通過縮合（C）結構域催化的醯胺化反應進入肽支架。其他步驟可通過差向異構化（E）和甲基化（甲基化酶，MT）結構域催化的PCP結合中間體反應來進行。C結構域的一個常見變體是環化（Cy）結構域，將半胱氨酸、絲氨酸或蘇氨酸等摻入中間體並將其環化為噻唑啉和𫫇唑啉。氧化（Ox）結構域可將這些雜環分別轉化為噻唑和𫫇唑。在經典NRPS中，遵循共線性規則，不同亞基選擇性地以非嚴格共價的管道相互作用形成最終完整的脂肽合成生產線（圖2）。NRPS亞基間的非共價相互作用是由專門的N端和C端對接結構域（DD）介導的。研究證明DDs中胺基酸交換不僅會導致體外蛋白質親和力的變化，而且會導致體內不同肽的產生。
圖2用於脂肽合成的非核糖體肽合成酶（NRPS）催化合成脂肽的典型過程
脂肪酸鏈的裝配和胺基酸的延伸是非核糖體肽合成過程中的重要環節。非核糖體肽合成酶每個模塊啟動並修飾一個特定的胺基酸（aa），然後通過下一個模塊啟動並修飾的aa對其進行延長，從而生成長度取決於所用模塊數量的肽。典型的NRPS延伸模塊由1個用於啟動特定胺基酸的腺苷化（A）結構域，1個用於形成肽鍵的縮合（C）結構域和1個巰基化（T）結構域組成。脂肽合成在宿主菌中，通過輔助元件促進胺基酸修飾、分子伴侶功能、產物輸出和宿主抗性。7種類型的結合元件按如下順序連接組裝：長鏈脂肪酸到L-胺基酸，L-胺基酸到L-胺基酸，L-胺基酸到D-胺基酸，D-胺基酸到L-胺基酸，L-胺基酸到手性胺基酸（如甘氨酸、肌氨酸），手性胺基酸到L-胺基酸，手性胺基酸到D-胺基酸。每一個胺基酸結合元件由兩個功能性模塊組成，每個模塊至少包括3個酶結構域，通過內蛋白連接（-）或間蛋白連接肽（：）依次連接（比如CAT-CAT、CAT-CATE、CATE-CAT、CATE:CAT）。連接脂肪酸到胺基酸的元件由脂肪醯連接酶（AL）和醯基載體蛋白（ACP）和一個NRPS模塊組成（例如AL:ACP:CAT或者AL-ACP:CAT）。自然界進化出3種類型的C結構域，分別連接脂肪酸到L-胺基酸、L-胺基酸到L-胺基酸、D-胺基酸到L-胺基酸；同時也進化出3種T結構域（或PCP肽基載體蛋白），與上游的AC結構域和下游的C結構域、與下游的E和C結構域、與下游的TE結構域相互作用。A結構域類型有多種，决定何種胺基酸將要被綁定、啟動和參與到胺基酸的偶聯過程中。
非核糖體肽合成酶的結構多樣性和各結構域的作用機制，决定了脂肽合成過程中多種同系物的產生。例如多黏菌素和鐮刀菌素，首先從多黏菌的菌株中分離出來。其中的多黏菌素是由環狀七肽和被N末端脂肪酸醯化的三肽側鏈組成的家族，包括多黏菌素A、B、D、E和M。研究表明，多黏菌素B1的藥代動力學與商用購買的多黏菌素B混合物存在顯著差异，單一純組分的藥理學活性並不能推廣到商業使用的混合物。不同品牌的多黏菌素雖有類似的組成，但抗菌活性存在差异。藥代動力學發現儘管脂肽中只有一個胺基酸差异，多黏菌素A和B與血漿結合能力低於多黏菌素B1、B2，體內清除能力和在腎臟的積累差异明顯，囙此對現時可用於臨床的脂肽商品的組成成分需要更嚴格的控制和標準化。Roberts等發現N末端只有一個碳差异的多黏菌素B1和E1對細胞的體外凋亡作用有顯著差异，與商業多黏菌素產品相比，單獨的脂肽組分具有更多的體內抗微生物活性。
NRPS進化過程主要包括4個種類：複製和協同進化；通過複製和重組產生的結構域N末端添加；和其他生物合成基因簇（BGCs）進行結構域的交換；不同胺基酸特异性結合位點的快速突變以及多個過程的組合進化。天然產物生物合成的遺傳基礎揭示了遺傳改變引起化學結構多樣性的重要作用。基於NRPS進化過程，對NRPS生產線中的結構域進行非理性改造，重構生物合成途徑的遺傳成分可以有效改變脂肽的產品特性和同系物的組分，以及產生“非天然”的天然產物。天然產物類似物可以通過改變不同的合成階段產生，如前體物導向的生物合成、工程化改造合成過程中涉及的巨酶、模塊組裝後的修飾等。通過對達托黴素和A54145 NRPS生產線的改造產生了超過120種非天然衍生物。通過重組來自不同菌株（Photorhabdus，Xenorhabdus and Bacillus）NRPS亞基產生了10多種新型脂肽。
3脂肽合成和調控研究進展
傳統脂肽類似物化學合成的方法，嚴重限制了脂肽合成的整體效率，抗菌活性顯著降低，且脂肽結構的多變性不適合化學合成。同時化學合成的過程存在產量少、污染大、成本高等問題。脂肽合成結構域的一個或多個改變可以改變胺基酸的種類與數目，同時脂肪酸醯化酶以及縮合結構域對脂肽脂肪酸的特异性具有調控作用（錶1）。脂肽合成過程的順利完成會受到多個代謝途徑和代謝過程的影響和調控（圖3）。
錶1脂肽合成域改造調控相關研究
圖3脂肽合成的主要代謝途徑
3.1脂肽合成的代謝工程改造
脂肽類天然產物是現時生物製劑研究的熱點，但是長期以來，成本高、產率低一直是制約脂肽類物質微生物合成的難題，利用基因工程技術和代謝工程方法構建高效合成脂肽類物質的工業菌株具有十分迫切的需求。不同於初級代謝產物的合成，脂肽類天然產物作為一種重要的次級代謝產物，其代謝網路更為複雜，往往需要多種初級代謝產物如各種胺基酸、脂肪酸及其衍生物的參與，其合成受到多種途徑特异性因數和複雜的全域調控因數調控。而且大多數脂肽合成基因簇是沉默的或者表達效率低，無法高效啟動制約著產物的合成。通過優化前體代謝、提高脂肽合成基因簇表達、阻斷脂肽合成競爭途徑、各類調控因數的改造可以有效提高脂肽產品的合成。
研究最多也最為成熟的是表面活性素的合成。Wu等在模式菌株Bacillus subtilis 168中綜合了完整的表面活性素合成酶基因簇sfp，實現表面活性素從無到有的積累；删除與生物膜形成相關的基因和非核糖體多肽合成酶/多酮合成酶途徑來减少競爭，表面活性素產量提高3.3倍；過表達細菌自我抗性相關蛋白，表面活性素產量提高8.5倍；强化前體支鏈脂肪酸的合成途徑，表面活性素產量提高20.3倍；强化srfA表達，使乙醯輔酶A節點處的代謝流從細胞生長轉移到表面活性素生物合成，表面活性素產量進一步得到提升。Wang等通過過表達B. subtilis TS1726中生物素羧化酶Ⅱ基因yngH增强脂肪酸的供應，表面活性素產量較對照提升43%，達到13.37 g/L。此外，Dang等通過過表達多效性調節因數DegQ，使伊枯草菌素（iturin A）的產量提高11.8倍。Xu等利用强啟動子PbacA控制iturin A合成酶基因簇，iturin A產量提升132.15%，敲除iturin A合成酶操縱子負調節基因abrB，iturin A產量進一步提升19.8%，結合培養條件優化，產量最終達到（2013.43±32.86）mg/L。Huang等突變失活負調節基因wblA，達托黴素（daptomycin）產量提高51%。利用代謝工程策略有效提高了脂肽產品的產量。但是基於前體物導向和調控因數導向的改造方法，仍無法解决產物中多組分同系物共存或高價值組分比例低的問題，往往導致發酵過程和產品批次的不穩定，制約著脂肽類化合物產品品質的提升。囙此，對脂肽多組分同系物的調控也格外重要。
3.2肽鏈胺基酸對脂肽同系物組分調控
NRPS調控產生新肽產物的研究涉及：①通過啟動替代底物的A結構域的替換；②A結構域的底物結合口袋的改變；③CA結構域作為不可分割的整體替換（圖3）。A結構域的取代可以改變NRPS模塊對胺基酸底物的選擇性，可以成功提高所需結構類似物的濃度。Uguru等對CDA合成酶中的天冬氨酸A結構域定向突變導致產生含有天冬醯胺的十二氫萘的肽和一種特殊的線性六肽中間體。Schauwecker等通過將N-甲基纈氨酸活化結構域取代纈氨酸活化結構域，導致催化非甲基化和N-甲基化醯基二肽的合成。Kim等第1次用基因工程的方法對多黏菌素合成酶進行改造，通過在多黏菌素A編碼基因的基礎上替換多肽鏈上的A結構域，合成了多黏菌素E、B、P。Kries等通過替換A結構域的結合口袋部分，將編碼不同特异性的亞結構域移植到對Phe特异性的GrsA模塊中，得到了不同的蛋白。通過交換具有不同胺基酸特异性的外源A結構域可能導致生產不是後續生物合成步驟的中間體，另外，A結構域操縱策略可能受到對受體底物顯示特异性的上游C結構域的限制。Ackerley等在pvdD的第1個模塊中的結構域替換實驗發現還有可能的原因是取代結構域的來源不同，或是結構域的取代損壞了上下游的結構，C結構域也可能表現出一定程度的供體位點特异性。儘管對A結構域進行替換、突變、删除、插入等基因操作可以有效改變脂肽中胺基酸的種類和數量，肽殘基數量的减少或新增是產生脂肽結構多樣性的替代方法，但是這些操作可能會導致產物的產量减小和活性降低。
除了對胺基酸具有特异性的A結構域外，有些脂肽NRPS模塊中還有特殊的結構域影響脂肽的結構。Duerfahrt等利用Cy結構域代替C結構域，產生新型雜環二肽。使用重組TE結構域來催化脂肽區域特异性環化是產生具有改進性質的新化合物的有力方法。de Ferra等通過將C末端TE結構域移位到內部結構域來修飾SrfA，從而導致產生新的線性表面活性素類似物。Schwarzer等發現异源NRPS的TE結構域可以選擇性地控制肽鏈的環化與終止，產生結構多樣性。
3.3多結構域對脂肽同系物組分調控
通過進行多個結構域的替換，或通過引入腺苷化（A）和硫醇化（PCP）結構域的融合或者腺苷化（A），肽基載體蛋白（T）和縮合結構域（C）的融合，可使多肽中胺基酸重新排列。Mootz等將目標模塊與tyrocidine合成酶的前兩個模塊以及硫酯酶結構域融合，獲得預測的新型三肽。Duerfahrt等通過融合包含腺苷化（A），肽基載體蛋白（T）和縮合結構域（C）的Asp和Phe啟動模塊，實現了6種不同的Asp-Phe合成酶的轉錄。囙此，應該優選在PCP和C結構域之間選擇NRPS模塊的融合體，以使CA連接完整。通過用分枝杆菌素和黏噻唑菌醇的MbtB和MtaD模塊取代支化環狀噻唑啉NRPSs中BacA的第2個模塊，將整個D-羥基苯基甘氨酸模塊插入模塊4和5之間的巴林黴素中導致生成八肽產物。這些研究主要集中在保持CA或CAT結構域完整的交換，同時僅在域間連接區域進行域融合。通過使用基因缺失、基因交換、雙重和三維交換，整個模塊交換和多模塊交換的組合產生了足够數量的新型脂肽抗生素。但是，在多數情况下僅表現出發酵過程中最豐富的脂肽成分，新型脂肽以及衍生物占比很低。為了實現商業規模的脂肽生產，運用合成生物學策略，通過工程化生物合成途徑，有望快速提高單一組分脂肽產量和產品品質。
3.4脂肪酸側鏈對脂肽同系物組分調控
脂肪酸鏈以不同的管道綜合進入脂肽，包括醯基輔酶A連接酶和ACP編碼基因的存在，以及獨特的N末端C結構域共價連接到第1個胺基酸的載體蛋白質結合。單獨的醯基轉移酶是脂肽的脂肪醯基摻入脂肽所必需的，但在一些脂肽基因簇以及基因簇附近未發現負責將N末端脂肪醯基連接與脂肽酯化作用的脂肪酸連接酶。脂肽基因簇的第1個C結構域（starter C）可能介導脂肪醯基和第1個胺基酸的連接，在鈣依賴性抗生素（CDA）基因簇中starter C結構域表現出在其供體位點對醯基載體蛋白（ACP）的高特异性，在受體位點對CP的鬆弛特异性，但是對附著的底物具有高選擇性。達托黴素是一種環脂肽類抗生素，對革蘭氏陽性菌具有優良抗菌活性。達托黴素和A54145具有將長鏈脂肪酸與第1個胺基酸偶聯的特殊CAT起始模塊，醯基連接酶（AL）和醯基載體蛋白（ACP）參與A21978C和A54145生物合成過程中脂肪酸的活化和偶聯。在玫瑰孢鏈黴菌合成達托黴素的過程中，A21978C基因簇中DptE和DptF涉及將長鏈脂肪酸與胺基酸的偶聯進而引發A21978C的生物合成。starter C結構域之間的異質性，反映了不同脂肪酸的物理調節或與對接和轉移活化的醯基硫代酯構建脂肽的特定載體蛋白的相互作用。所以，C結構域中的底物選擇性可能是脂肽合成酶控制和進行有效工程化改造的另一個障礙。通過在脂肽合成途徑之間交換N末端C結構域，或者將它們添加到不被醯化的產物NRPS中，將使脂肪醯基的N末端改造成為可能。脂肪酸側鏈供給的調節是對脂肽同系物組分調控策略之一。
現時新型脂肽的合成包括了脂肪酸側鏈改變下形成的新型脂肽，如N-甲基化和脂肪酸偶聯合成的具有高效抗菌活性和高蛋白水解穩定性的新型蜂毒抗菌肽anoplin類似物。突變lpdV基因改變了枯草芽孢杆菌對脂肪酸鏈的選擇性，更傾向於合成表面活性素C14。突變起始縮合結構域的活性位點改變了脂肪酸鏈的特异性，進而合成A54145的同系物。
3.5外源添加對脂肽同系物組分調控的影響
脂肽的前體脂肪酸除了生物合成外還可以通過初級代謝來提供，所產生的代謝物的種類根據生長培養基的組成和培養條件而變化，所涉及酶的底物特异性的變化導致最終產品性質的改變。脂肽側鏈的分佈在一定程度上可以通過加入特定的脂肪酸或胺基酸來調節。脂肽同系物的醯基可以通過脂肪酸補充來改變，在發酵過程中A54145環脂肽可以產生大量的同系物，但它們的比例可以通過添加胺基酸（L-Val、L-Ile或L-Glu）來調節，而加入各種中鏈脂肪酸（如己酸、辛酸或壬酸）會產生新的醯基衍生物。Ding等研究發現，添加肉豆蔻酸、十五烷酸、棕櫚酸、十七烷酸、十八酸和壬酸等外源烷酸可以促進脂肽的產生，增强解澱粉芽孢杆菌Pc3脂肽粗提物的抗真菌活性，利用奇數碳鏈長的烷酸可進一步提高解澱粉芽孢杆菌Pc3中iturin A C15的合成量。外源添加調控脂肽合成相關研究見錶2。
錶2外源添加調控脂肽合成相關研究
外源添加胺基酸對脂肽的產量有直接影響。Zhou等研究發現在培養基中添加L-Leu後表面活性素產量顯著增加，而添加D-Leu後表面活性素產量急劇下降，結果表明L-Leu作為前體或底物參與了表面活性素的合成，而D-Leu可能是競爭性抑制劑抑制了表面活性素的合成。添加L-Asn、L-Pro和L-Ser的複合胺基酸可提高iturin A的產量，且外源添加的L-Ser濃度與iturin A產量呈正相關，說明L-Ser是iturin A生物合成途徑中的限速化合物。L-Ile的加入極大提高了多黏菌素B1的比例，而L-Glu和L-Gly存在時多黏菌素D1和D2含量顯著增加。通過補充胺基酸（L-Ala、L-Arg、L-His、L-Cys、L-Asn、L-Gln、L-Ser和L-Thr）會以濃度依賴性管道刺激多黏菌素D1和D2的產生，而低濃度（0.5 mmol/L）的L-Lyr有利於多黏菌素D的合成，多種多黏菌素D類似物顯著低於多黏菌素D1和D2。這些研究表明，胺基酸添加對多黏菌素等環脂肽同系物組分的調控至關重要。
Bartal等研究表明使用葡萄糖以外的碳源對表面活性素產量也會產生影響，而且在某些情况下表現出選擇性。添加麥芽糖、纖維二糖和蔗糖分別對1個（C16）、2個（C13、C16）和4個（C13、C14、C17、C18）組有顯著的負面影響，甘露醇和乙醇的使用分別新增了C15和C15-C16組的相對量，但也使某些組的合成减少。此外，發酵培養基中添加不同的金屬離子可以通過促進細胞生長、影響氮利用和其他可能的未知機制來顯著影響脂肽的產量。Lin等通過添加亞鐵離子提高瞭解澱粉芽孢杆菌產iturin A的能力。Cooper等研究發現錳和鐵鹽的加入可以提高表面活性素的產量。Bartal等研究表明金屬離子的使用對表面活性素的影響較大，並且發現了第5比特含有AME5的表面活性素同系物。其檢測結果還表明金屬離子促進了更長脂肪酸鏈的脂肽化合物產生，產物中有2/3是C16、C17或C18的表面活性素同系物。
4幾種常見環脂肽的合成調控
4.1多黏菌素
多黏菌素（polymyxin）是由多黏類芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）產生的一組多肽類抗生素。對大多數革蘭氏陰性菌有抑制作用。多黏菌素的肽鏈由10個胺基酸組成，結構上為線性三肽連接環狀七肽，不同位點胺基酸種類和構型的差异形成了不同的多黏菌素同系物。多黏菌素胺基酸序列為：L-Dab-L-Thr-3-L-Dab-L-Dab-6-7-L-Dab-L-Dab-L-Thr。其中前3比特的胺基酸呈線形連接，後7比特的胺基酸呈環形。第3、6、7比特胺基酸的不同决定了其同系物的種類（錶3）。對多黏菌素NRPS的部分結構域進行改造，可以達到改變產物中多黏菌素同系物比例的目的（圖4）。Yuan等通過替換P. polymyxa CJX518中多黏菌素合成酶基因簇pmxA中的A結構域和pmxE中的C結構域，獲得了B1組分提高，Ile-P-B1和B3組分降低的重組菌株。Kim等通過將P. polymyxa E681中第7比特L-Thr特异性的A結構域替換為來自P. polymyxa ATCC 21 830中L-Leu特异性的A結構域，第6比特D-Leu特异性的A結構域替換為來自P. polymyxa F4的D-Phe特异性的A結構域，在B. subtilis BSK4dA中表達並成功合成了polymyxin B和E。
錶3多黏菌素同系物化學結構
圖4多黏菌素合成的NRPS結構域改造
4.2表面活性素
表面活性素的肽鏈包含7個胺基酸，序列為L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu，首位的L-Glu和第7比特的L-Leu連接形成七肽環。表面活性素肽環的第2、3、4、6、7比特胺基酸為疏水性胺基酸，第1、5比特為親水性胺基酸。與多黏菌素不同，表面活性素的肽環比較穩定，由肽環胺基酸改變形成的表面活性素同系物較少。表面活性素肽環的化學結構見錶4。Stachelhaus等通過同源重組靶向替換了B. subtilis srfA操縱子中的胺基酸啟動結構域。Schneider等在B. subtilis中通過體內重組的管道將亮氨酸啟動模塊替換為鳥氨酸啟動模塊，將鳥氨酸直接結合在肽環第2比特，形成了實質性的肽環構象變化。Eppelmann等通過比較和同源建模分析了NRPSs的底物選擇性編碼序列，而後對表面活性素合成酶的srfA序列進行定點突變，合理地改變了NRPS模塊的底物特异性。Jiang等敲除了B. subtilis BP2-L1中的SrfA-A-Leu、SrfA-B-Asp和SrfA-B-Leu模塊，其中敲除了第6比特Leu的表面活性素變體表現出更顯著的抗真菌活性。
錶4表面活性素同系物化學結構
4.3豐原素
豐原素的肽環結構類似於多黏菌素，由線性二肽連接環狀八肽而成。第3比特和第10比特胺基酸之間以內酯鍵成環。豐原素肽鏈胺基酸序列為L-Glu-D-Orn-3-4-L-Glu-6-L-Pro-L-Gln-9-10。根據已有的報導，第3、4、6、9、10比特的胺基酸决定了豐原素的不同構型。fengycin A和fengycins B是最常見的兩種亞型，它們的胺基酸序列為L-Glu-D-Orn-D-Tyr-D-Thr-L-Glu-6-L-Pro-L-Gln-L-Thr-L-Ile。區別在於第6比特的胺基酸，fengycin A是D-Ala，fengycin B是D-Val。fengycin C是fengycins家族的一個新亞型，由一個七肽鏈和脂肪酸鏈相連而成。其胺基酸序列為：L-Glu-D-Orn-D-Tyr-D-Thr-L-Glu-D-Val-L-Pro-L-Gln-D-Thr-L-Ile。fengycin C在第9比特的胺基酸與fengycin B不同，在第6比特和第9比特的胺基酸與fengycin A不同。fengycin S分離自B. amyloliquefaciens，與fengycin B相比，該亞型在第4比特是D-Ser，而不是D-allo-Thr。豐原素同系物見錶5。
錶5豐原素同系物化學結構
plipastain是fengycin的一類重要同系物，其胺基酸序列為L-Glu-D-Orn-L-Tyr-D-allo-Thr-L-Glu-D-Ala/Val-L-Pro-L-Gln-D-Tyr-L-Ile。plipastain同樣包含幾種不同的同構型，plipastain A和plipastain B在第6比特胺基酸分別為D-Ala和D-Val。Ma等從B. amyloliquefaciens SH-B74的發酵液中分離鑒定出plipastain A1，其胺基酸序列為L-Glu-D-Orn-L-Tyr-L-Glu-D-Ala-L-Pro-L-Gln-D-Tyr-L-Ile。Gao等通過單個結構域缺失策略來設計plipastain的生物合成途徑，生成了新型的線性五肽、六肽的plipastain衍生物。將plipastain合成酶的TE結構域前移到上一個模塊的T域位置，從而合成預測的線性肽鏈plipastain衍生同系物，同時揭示了plipastain TE結構域在NRPS合成酶系中的區域選擇性。
4.4達托黴素
達托黴素是鈣依賴性環狀脂肽類抗生素A21978C組分中的一種，最初從玫瑰孢鏈黴菌（S. roseosporus）的發酵液中分離出來，對多種革蘭氏陽性菌均顯示出優异的活性，但對革蘭氏陰性菌則無活性。達托黴素和脂肽A21978C組的所有其他成分是通過相同的模組化非核糖體合成酶系統合成的，並包含相同的肽部分。它們之間唯一不同的結構部分是N末端連接的脂肪醯基殘基。常見肽段包含13個胺基酸，其中6個非蛋白質胺基酸：D-Asn2，鳥氨酸（Orn6），D-Ala8，D-Ser11，（2S，3R）-谷氨酸甲酯（MeGlu12）和犬尿氨酸（Kyn13）。C末端的10個胺基酸形成一個大環覈心，該覈心在Thr4的側鏈與C末端Kyn13的α-COOH之間包含一個閉環酯鍵。N末端三肽從環突出，並帶有可變的脂肪醯基殘基，該殘基與Trp1相連。脂肪醯基殘基的性質會影響抗菌活性和毒性，其衍生物的挖掘也主要通過改變不同的脂肪酸側鏈來進行，而胺基酸的改變往往導致活性和產量的下降。發酵過程中通過外源添加不同的脂肪酸或脂肪酸酯可以被反異構十一烷醯、反式十二烷醯、反異構十三烷醯等基團替代，得到新的達托黴素型衍生物。達托黴素同系物見錶6。
錶6達托黴素及其同系物
4.5伊枯草菌素
伊枯草菌素是一種主要由芽孢杆菌產生的抗生素環脂肽，具有溶血和抗真菌的特性。伊枯草菌素的肽鏈包含7個胺基酸，經典的胺基酸序列為L-Asn-D-Tyr-D-Asn-L-Gln-L-Pro-D-Asn-L-Ser，其中第5比特和第7比特胺基酸可變性較强。伊枯草菌素包含眾多的同系物，包括iturin A、iturin C、iturin D、bacillomycin D、bacillomycin F、mycosubtilin。現時雖然對伊枯草菌素模塊與結構域間的作用已經研究清楚，但對於修飾改造其肽鏈胺基酸生成新型同系物的研究還比較少，囙此在未來的研究中可嘗試針對性的研究。伊枯草菌素同系物見錶7。
錶7伊枯草素同系物化學結構
脂肽家族成員眾多，除了上述5種環脂肽外，對其他脂肽結構域的改造也有許多研究，既包括常見的結構域替換、删除，也有對其進行點突變和模塊融合的研究。通過對胺基酸啟動模塊以及脂肪酸綜合模塊進行修飾和再造，可以得到一些活性或產量提高的產物、有用組分增大的同系混合物以及新型脂肽等。
5混菌對脂肽生物合成的影響
現時，人工混菌研究已從混菌組成的生態關係向提升混菌合成功能產品的效率方向發展。針對脂肽生物活性物同系物組分多、功能可控性差、產量低問題，進行人工微生物混菌系統的構建，可以解决前體物質水准與脂肽同系物複雜性之間的關係，同時可能提高多細胞體系的代謝功能和效率，實現純培養微生物無法完成的任務。在群體效應等細菌群體行為調控機制中，鏈黴菌可接受其他細菌產生的小分子訊號物質，以及在環境脅迫等多重壓力下可自發啟動次級代謝產物合成基因簇的表達。Steptomyces endus S-522和Tsukamurella pulmonis TP-B0596的共培養，可誘導產生新的抗生素alchivemycin A。將環境中產生表面活性素的地衣芽孢杆菌和假單胞菌菌種與生物膜形成菌株（銅綠假單胞菌和無病李斯特菌）混合發酵可以促進表面活性素產量的提升。Woźniak-Karczewska等發現不同菌群間的群體效應和混菌培養影響生物表面活性素同系物的形成。混菌體系的豐富性也賦予其更强的生物防治、石油降解等能力。B. amyloliquefaciens ACCC11060和T. asperellum GDFS1009共培養，使抗菌脂肽對真菌B. cinerea抑制能力的顯著提升。B. subtilis SPB1和A. radioresistens RI7菌株混合培養時，可將柴油降解率提高到55.4%。人工構建脂肽合成的生態系統（多細胞體系）將擴大脂肽類物質的生產和應用潜能。
6合成生物學用於脂肽合成的研究
合成生物學是一門綜合的學科，以傳統生物學獲得的知識和資料為基礎，利用系統生物學的手段對其加以定量的解析，在工程學和電腦的指導下設計新的生物系統或對原有生物系統進行深度改造。由於NRPSs多模塊多酶的複雜性，導致來自非核糖體肽合成酶的新次生代謝產物的組合生物合成一直處於緩慢發展。環脂肽類天然產物含有多種組分，其組成和結構影響整體生物活性。運用合成生物學策略對非核糖體肽合成酶异源表達實現環二肽的生物合成，由3個非核糖體肽合成酶（OctA、OctB、OctC）合成的脂肽（octapeptin，八肽菌素）能有效抗革蘭氏陰性耐藥菌。對NRPS合成操縱子的生物資訊學分析可以較為直觀地分析不同脂肽同系物合成序列的差异，將組合生物合成科技與序列比對、同源建模等方法結合起來，定向地對NRPS合成酶進行改造，從而達到精准合成預測產物的目的。
隨著基因組裝科技的發展，更加靈活和精准的方法應用於脂肽合成中模塊結構域的改造，距離人工設計脂肽肽鏈構型生物精准合成的目標也日益趨近。Yan等基於type IIS限制性內切酶酶切尅隆的方法創造了通過質粒高效組裝NRPS生產線的方法，可以輕鬆實現對各功能結構域的替換，促進了新型生物合成基因簇的開發和藥物發掘。囙此，運用合成生物學策略合成NRPSs的標準化元件和模塊生產新結構脂肽，結合微生物基因組挖掘將擴大NRPS源天然產物藥物範圍和提升新藥的發現速度，利用合成生物學在工程化的釀酒酵母中設計完成多細胞真菌複雜的生物合成，將加快非核糖體肽抗生素理性工程化合成。此外，利用合成生物學思想設計與構建基於前體物導向和脂肽合成模塊的不同功能分工的人工細胞，通過群體機制迴響指導不同分工細胞內模塊的集成原則，提高菌群合作和效能也將促進生物合成脂肽類活性物質的開發。
總結與展望
環脂肽作為抗生素、生物表面活性劑等，在生物防治、藥物開發、環境修復和疾病治療等方面廣泛應用，具有迫切的市場需求和廣闊的發展前景。特別是脂肽類抗生素因其臨床耐藥菌株的出現概率極低、可生物降解、多生物活性（抗菌、抗腫瘤、抗病毒等）、無交叉耐藥性等特點，在抑菌藥物中引起廣泛關注，預計未來10年準予用於臨床的脂肽類抗生素的數量將會不斷增加。同時，脂肽的生物合成還存在產量低、多種同系物共存以及產品和菌株特性造成的發酵過程難控等問題，限制脂肽類抗生素的工業化和商品化生產。本文綜述了環脂肽生物合成的研究進展，為進一步研究和開發脂肽類的應用提供依據。
現時，利用微生物生產脂肽類天然產物還存在一些困難，其中包括：①很多生產菌不能被培養，或是不能進行基因改造；②具有功能的潜在的生物合成基因簇（BGCs）需要進行尅隆，或是通過合適的外源宿主進行表達和基因工程改造；③由於複雜的細菌以及分子量龐大的BGCs基因，進行尅隆、途徑改造和構建重組文庫時存在困難；④在外源宿主中產量低，可能是由於轉錄效率低、蛋白質不正確折疊等原因。通過對野生菌株的實驗室馴化，利用和開發先進的基因編輯工具，構建合適的外源宿主等方法可以加快脂肽類天然產物的開發，强化其生物合成過程，解决基因表達和產物合成中的一些難點問題。DNA測序科技的反覆運算發展為菌株基因組的解析和基因簇蛋白功能的分析創造了有利的條件，以合成生物學中“設計”“構建”“系統”“標準化”的工程化思想為指導構建脂肽合成的人工細胞是今後研究脂肽物質生物合成的重要方向。
環脂肽多組分同系物嚴重限制它們的應用，特別是在生物醫藥領域的應用。就脂肽同系物組分人工調控而言，無論是不同功能結構域與同系物組分的相關性，還是前體供給與脂肽同系物組分和功能間的關係，有關獲取脂肽單一組分的調節機制尚不清楚，特別是人工微生物混菌系統來調控脂肽同系物組分的研究尚未見報導，囙此，進行底盤優越的人工合成體系的研究勢在必行。建立脂肽多組分同系物生物合成的人工調控策略，獲得可控的單一組分脂肽，提高其抗菌活性、降低脂肽同系物組分的生物毒性，具有重要理論意義和實際價值。囙此，在今後的研究工作中，有必要開展脂肽同系物單一組分生物合成人工調控的分子機制研究，為尋求脂肽同系物單一組分可控、高效合成的人工混菌系統工程改造和構建提供理論依據。為擴大環脂肽的應用領域，利用合成生物學科技開展原料高效利用、複雜底物響應機制和代謝途徑優化研究，尋找廉價底物用於環脂肽的合成，將是降低環脂肽生產成本的重要途徑之一。此外，脂肽類物質在反應器放大培養過程中還存在泡沫多、發酵過程穩定性差等問題，對發酵設備、發酵工藝和過程調控都具有較高的要求，通過設計和運用新型消泡生物反應器可以有效强化脂肽產品的發酵過程和提高過程的穩定性。隨著合成生物技術的迅速發展和運用，結合傳統的代謝工程和發酵工程手段的延伸，應用於脂肽類天然產物的微生物合成也有望實現產品“質”和“量”的提升。
致謝
謹以此文致敬Daniel I.C. Wang教授在基因工程及生化工程等領域的開創性貢獻。
通訊作者及團隊介紹
程景勝，天津大學化工學院教授，博士生導師。2006年畢業於天津大學獲博士學位，2010—2011年在美國麻省理工學院化工系Bioinformatics & Metabolic Engineering實驗室作訪問學者。教育部新世紀優秀人才計畫得主，主持和參與國家重點基礎研究發展計畫（973計畫）課題、國家重點研發項目、國家自然科學基金、科技部農業科技成果轉化等項目數十項。在Journal of Hazardous Materials、Bioresource Technology、Science of the Total Environment、Metabolic Engineering等期刊發表論文60餘篇，申請和授權發明專利數十項。
團隊主要從事抗菌活性物分子的發酵合成；細胞新功能創建、功能微生物菌劑開發；生物質綠色轉化以及抗生素高效降解等方面研究。
E-mail：jscheng@tju.edu.cn
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