《合成生物學》精選文章,|,酵母終止子工程,從機理探索到人工設計

終止子作為基因元件獨立於編碼基因行使終止轉錄的功能,是一種重要的合成生物學控制元件。這為研究人員開發合成生物學元件和异源合成途徑優化提供了科學的理論參攷。

生物系統的複雜性為生物元器件的構建提出了挑戰,新型控制元件的發現和穩定可調節的元件設計成為合成生物學的重要內容之一。終止子作為基因元件獨立於編碼基因行使終止轉錄的功能,是一種重要的合成生物學控制元件。研究表明終止子作用有强有弱,終止子的選擇會直接影響mRNA的量,並且隨著終止子結構與功能的逐漸清晰和對轉錄終止機理的深入解析,以短小、可控、可設計為特徵的終止子工程得以快速發展。本文以常規釀酒酵母為基礎,系統總結了釀酒酵母中終止子元件在結構發現、功能表徵、轉錄終止機理方面的最新研究進展,並討論了終止子的人工設計及在途徑工程精細調控領域的應用情况,展望了終止子工程面臨的挑戰、可能的解决途徑及在非模式酵母中發展的潜力和意義。這為研究人員開發合成生物學元件和异源合成途徑優化提供了科學的理論參攷。

合成生物學作為21本世紀一個充滿活力的新興交叉學科,以工程化思想理性設計改造生命體、創造新功能。該科技突破了生命發生與進化的自然法則,推動了解讀生命到編寫生命的跨越,可為破解資源、能源、健康、環境、安全等重大難題提供重要科技支撐。通過引入新的合成途徑或功能模組,已在微生物中實現了青蒿酸、人參皂苷、紫杉二烯、异丁醇等複雜或高值化合物的合成,在化學品合成、藥物發現與製造、農業生產等領域均表現出了重要的應用價值。

有效的生物元器件是途徑組裝和生命體改造的基礎,其中控制元件更是影響人工生物體系的重要因素之一。原核生物中含有上萬種調節線路,它們能够在轉錄或翻譯水准對環境訊號進行感應和應對,人們成功地從這些線路中挖掘出了啟動子、轉錄調控因數、核糖體結合位點等大量的控制元件,並構建了人工核酸開關等應用於代謝途徑的精細調控。但由於真核生物複雜的遺傳特性,在其中開發的控制元件相對單一,常見的控制元件主要是啟動子,限制了真核生物中合成線路的構建和應用。

近年來,科學家在釀酒酵母、大腸桿菌、病毒、哺乳動物和十字花科植物等物種中開展了大量的轉錄調控研究,發現不少基因的3′-UTR區域含有調控mRNA穩定性和亞細胞定位相關的功能元件。3′-UTR是mRNA上從終止密碼子到poly(A)尾巴的一段RNA序列,長度從幾百個堿基至上千個堿基不等,常為冗餘的重複序列,並且大多數可以形成莖環。將位於mRNA 3′-UTR區域內能够利用自身“髮卡”結構封锁RNA聚合酶Ⅱ在範本上移動,並與其他高度保守元件和蛋白因數共同合作實現3′末端的加工,給予RNA聚合酶Ⅱ轉錄終止訊號,促進轉錄終止的元件稱為終止子(terminator)。釀酒酵母每個基因的表達均受終止子元件的調控,當轉錄進行到3′末端時,終止子利用自身富含GC的區域形成一段穩定的髮卡結構,阻礙了RNA聚合酶Ⅱ在範本鏈上移動,導致轉錄終止。

不同活性終止子的使用能够影響mRNA的穩定性、切割效率、聚腺苷酸化反應以及3′-UTR區域的長度和穩定性,最終影響基因表達程度。基於對終止子關鍵覈心序列認識的不斷提高,以更短、效能更强、活性可控、可設計為特徵的終止子工程迅速發展。以這種表達“輸出”控制管道的工程應用也不斷湧現,表現出了良好的應用潜力。囙此,本文作者針對合成生物技術常用的釀酒酵母模式底盤,以機理探索到人工設計為主線總結終止子的研究進展,主要包括終止子元件的結構與功能、作用機理、人工設計及應用進展,並對終止子工程面臨的問題和發展趨勢做出討論,為開發合成生物學元件和异源合成途徑優化提供有用的資訊。

1釀酒酵母終止子的結構與功能

1.1終止子元件的基本構成

合成生物學按照工程學理念,將生命體系中發揮功能最簡單、最基本的單元統稱為生物元件,調控元件是生物調控的重要組成部分,啟動子、終止子、轉錄調控蛋白因數等可以作為調控元件作用於基因轉錄、翻譯水准。為了明確釀酒酵母mRNA 3′末端形成所涉及的元件,豐富途徑工程發展,1996年Guo和Sherman率先定義了酵母終止子形成所必需的最小元素集:效率元件(efficiency element,EE)、位置元件(positioning element,PE)、poly(A)位點[poly(A)sites,Py(A)n]以及圍繞poly(A)位點的富T區域[圖1(a)]。若將這些元素組合在一起,足够發揮酵母3′末端的轉錄終止功能。

圖1釀酒酵母終止子的基本結構與表徵方法

現已證明,效率元件一般位於終止子序列最上游,富含TA,序列TATATA、TATGTA、TACATA、TAAATA、TACCTA是常見的效率元件,當序列為TATATA時最有利於終止子效率檔案的活性,並有提高下游位置元件使用效率的作用。終止子的終止效果與效率元件的長度成正比,但效率元件的序列長度最少不能小於6 bp,大約50%終止子均有TATATA序列,其中第一和第五個堿基T對3′末端加工影響最大。另外,效率元件能够輔助下游位置元件定位,提高元件使用效率。mRNA 3′末端的形成需要poly(A)位點上游的恒定位置元件進行終止訊號的識別。位置元件是富含A的元件,位於poly(A)位點上游約10~30 bp,序列AAAAAAAA、TTAAGAAC、AAGAA、AATAAATGA、AAAAAA、AATAAA是常見的位置元件。當位置元件的序列為AAAAAA時,類似於哺乳動物中的六聚體定位poly(A)位點,終止子活性最强。位置元件募集大量轉錄終止因數、切割和多聚腺苷酸化因數共同完成加工和剪切過程,輔助識別切割位點,指導poly(A)位點的定位。Guo利用終止子CYC1t和ADH1t對poly(A)位點的序列進行了系統研究,表明poly(A)位點實際序列由胞苷或胸腺嘧啶加上一個或多個腺苷殘基組成,夾在兩個富含U/GU的側翼序列之間,TTTCAAA是聚腺苷酸化發生的最佳序列,切割位點通常發生在核苷酸CA上,第二個核苷酸A始終是一個發生切割的腺苷殘基,切割完成後添加poly(A)尾巴標誌著轉錄完成,poly(A)位點的位置主要由效率元件和位置元件共同决定。側翼富含U/GU的區域可用於調節poly(A)位點的使用效率和精確t切割位置,以完成mRNA 3′末端的多聚腺苷酸化加工形成成熟的mRNA。

顯然,這些簡單的元素共同參與了3′末端的形成過程,但其他序列也會影響終止子的强度。研究表明,終止子的終止作用除了與上述元件及它們的序列有關之外,還與各個元件之間的連接序列Linker 1和Linker 2的序列和長度有關。如果效率元件、位置元件和poly(A)位點的序列是確定的,那麼Linker 1序列的GC含量和Linker 2序列形成的莖環結構將成為影響終止子强度的重要因素。Guo等通過CYC1-lacZ融合基因的轉錄分析證明,位置元件與效率元件相距10~20 bp,與poly(A)位點相距10~30 bp。

1.2終止子的功能表徵

終止子的活性一般通過所控制基因的蛋白質表達水准來表徵。常利用綠色螢光蛋白基因(eGFP)、紅色螢光蛋白基因(mKO2)等報告基因為功能基因,將終止子插入報告基因的下游,通過流式細胞儀等手段檢測報告基因的表達情况,可將樣品螢光值([GFP]t)與對照組螢光值([GFP]0)差值的對數(FI)作為終止子活性值,該值越大表明終止子的轉錄終止能力越强[圖1(b)],(P1為對照組-eGFP陰性區域,P2為樣品組-eGFP陽性區域)。終止子是3′-UTR區域的功能元件,多為重複的冗餘序列,常將位於基因3′-UTR區的序列認為是終止子所在區域,囙此在分析終止子時,常將蛋白質編碼序列下游約500 bp的序列或全部序列作為終止子元件,每個編碼序列都與一個實質性的3′-UTR序列相關。Yamanishi等從酵母基因組中尅隆出約500 bp的3′-UTR區域,在eGFP下游插入不同的終止子,表徵了釀酒酵母5880個基因中的5302個終止子,相對於PGK1終止子的FI值而言,發現酵母天然終止子的活性範圍可達0.036~2.52。Curran等表徵了34個不同的酵母終止子,發現最活躍的終止子能使目標基因的mRNA半衰期新增2.5倍,而使蛋白質過表達6.5倍。

1.3終止子的分類

為了方便終止子研究與使用,可將終止子根據活性大小按照强、中、弱進行分類。由於强終止子序列更容易形成穩定的髮夾結構,不僅能够更快速地封锁RNA聚合酶Ⅱ在範本鏈上繼續前行,促進轉錄終止,也能提高mRNA的穩定性,新增蛋白質的積累。囙此强終止子的使用能够提高mRNA和蛋白質的產量。弱啟動子與强終止子的互補使用能達到和强啟動子相似的基因表達效果,甚至某些情况下弱啟動子結合中强度終止子可以使蛋白質表達效率提高幾倍,但誘導型啟動子和强啟動子與終止子活性的影響不大。研究酵母轉錄和聚合酶的催化中心發現,終止子的終止調控作用是酵母基因表達不可或缺的。終止子作為基因調控元件,主要功能是負責轉錄終止、mRNA 3′末端加工,最終通過影響mRNA的穩定性、翻譯效率和定位調節蛋白質的產生。然而,終止子作為基因元件是獨立於報告基因和編碼區序列而行使功能的,其活性不受所表達功能基因的調節。通過量測天然終止子的活性,已經確定終止子的缺失會導致轉錄過程的冗長,而出現轉錄不穩定。本課題組前期用eGFP驗證了糖酵解途徑和TCA迴圈途徑中的100個終止子,以釀酒酵母基因組為範本擴增相應的終止子片段,構建“TYS1p+eGFP+Terminators”基因表達盒,流式細胞儀檢測終止子强度,也發現了天然終止子的活性差异,强度範圍可達0.0613~1.8002。以常用的終止子PGK1t的FI值為標準,人為地將FI值小於0.0613的終止子劃分為弱終止子;將FI值大於0.9826的終止子劃分為强終止子;將FI值在0.0613和0.9826之間的終止子劃分為中等强度終止子。囙此,在100個酵母天然終止子文庫裏含有45個强終止子、31中等强度終止子和24個弱終止子,其中終止子MIC60、SOR1t、ELO2t、NTA1t、MMS22t和GRS2t是第一次被表徵和報導。

2釀酒酵母終止子的轉錄調控機理

轉錄是將RNA聚合酶募集到啟動子,合成mRNA並在終止子序列上解離RNA聚合酶的高度複雜的過程,受到多種因素的影響。其中兩個關鍵的轉錄調控事件是轉錄起始調控和轉錄終止調控。轉錄調控指通過改變轉錄速率從而改變基因表達的水准,可以控制轉錄何時發生以及產生多少,是基因表達調節控制中的一個重要環節。研究表明,基因正確的表達需要RNA聚合酶II的有效終止以避免轉錄干擾和非編碼RNA的合成。終止滯後將破壞同一染色體上的其他基因表達;終止提前將產生縮短的有缺陷的mRNA,從而導致蛋白質的變異,囙此轉錄過程受到嚴格的調控。酵母的轉錄終止涉及轉錄終止因數、多聚腺苷酸化因數、組蛋白、核小體等,終止子利用自身的功能元件募集這些調控因數共同完成轉錄終止。

酵母mRNA 3′末端是通過轉錄終止形成的,與其他高等真核生物相比,使用了更加複雜的加工機制。從機制上講,終止子定義了3′-UTR的序列和結構,在3′末端發出轉錄終止訊號並利用自身元件募集蛋白因數負責轉錄終止,切割新生的mRNA鏈發生聚腺苷酸化反應,有助於mRNA的穩定性。終止子區域的活性與mRNA豐度成正相關,表明終止子是mRNA豐度的决定因素,由於終止子在mRNA加工中的重要性,最不活躍的終止子區域傾向於編碼更長的3′-UTR區域,缺少終止子會產生延伸的轉錄本,導致轉錄本不穩定而無法翻譯。

2.1轉錄終止因數在轉錄調控中的作用

終止子元件作為3′末端區域重要的調控元件,具有調控mRNA亞細胞定位、穩定性及翻譯效率的作用。終止子區域的轉錄加工通常涉及兩個調控過程,轉錄終止涉及3′末端mRNA的切割和poly(A)位點的剪切;轉錄後調控涉及3′-UTR區域的穩定性、翻譯效率和mRNA的定位。終止子內的高度保守序列招募RNA結合蛋白和相關蛋白因數,用於轉錄後調節基因表達的各個方面。具體而言,終止子元件上的功能元件作為轉錄終止的修飾位點,通過招募與轉錄調控相關的切割因數IA、切割因數IB、聚腺苷酸化特异性因數複合物CPF,共同完成3'末端複雜的加工機制。在釀酒酵母中已經鑒定出超過20種以上的蛋白質因數與mRNA 3′末端加工有關,但大多數蛋白質因數都沒有關於詳細功能的解析或與終止子結合靶標的資訊。

終止子通過切割因數IA、切割因數IB識別自身效率元件和位置元件進行3′末端的加工和切割。而多聚腺苷酸化反應首先由切割因數IB和CPF蛋白質複合物識別終止子元件上的ploy(A)位點及圍繞ploy(A)位點的富U/GU區域進行切割,在多聚腺苷酸聚合酶的催化下,3′末端會合成具有一定長度的ploy(A)尾巴,將mRNA從細胞核內轉運至細胞質中翻譯成蛋白質。切割因數IA、IB的亞基根據其不同的蛋白質結構域和裸露在外的胺基酸殘基行使不同的功能,結合不同的終止子區域(圖2)。突變或過表達切割因數IA、IB均會造成轉錄終止缺陷,但並不會完全停止轉錄。同樣,終止子的缺失可能延長轉錄過程造成下游基因的通讀,導致目標基因和蛋白質表達量的减少。遺傳和功能研究表明轉錄終止因數與RNA的精確結合對於3′末端轉錄終止有巨大作用,在當前的釀酒酵母轉錄終止因數研究中,僅有非編碼蛋白Nrd1、Nab3在全基因組上的靶標RNA序列研究較為清楚,分別識別UGUAG/A和UCUUG。另外,現時已確認轉錄終止因數Pcf11、Rtt103、Mbp1、Fkh1主要作用於聚腺苷酸化反應,但它們如何與終止子結合行使終止功能還不完全清楚。

圖2釀酒酵母終止子參與的可能終止機理

在上述轉錄終止因數中,發現切割因數IB家族包含的轉錄終止因數Pcf11與裂殖酵母、哺乳動物、人、果蠅等中都含有類似的功能同系物,並貫穿於整個轉錄終止過程,推測Pcf11具有多種功能。第一,Pcf11能够識別終止子區域上的位置元件,利用自身蛋白質結構域招募蛋白質因數Clp1、Rna14、Rna15和切割與多聚腺苷酸化因數CPF共同完成3′末端加工過程,同時促進新生pre-RNA鏈從DNA-RNA-RNA複合物中釋放,促進轉錄終止。第二,Pcf11介導與ploy(A)位點相關的切割和多聚腺苷酸化反應,在ploy(A)位點處完成切割並添加ploy(A)尾巴,促進mRNA成熟,並與非編碼RNA結合切割內含子連接外顯子,構建不同長度的轉錄本。第三,在轉錄延伸過程進行到3′末端時,Pcf11蛋白發生磷酸化反應與RNAP II Rbp1亞基CTD區域中磷酸化的Ser2、Ser5結合,促進mRNA切割、RNAP II從DNA範本鏈上的解離,開啟下一輪轉錄。總之,轉錄終止因數Pcf11通過識別終止子元件,參與mRNA 3′末端的加工和聚腺苷酸化反應,既能影響轉錄終止的時機又能調控mRNA的穩定性,對轉錄過程具有全域調控作用,是一種重要的潜在全域調控元件。然而,現時對其具體的轉錄終止機制還不清楚,特別是關於Pcf11是如何與終止序列識別並響應的、它的靶標RNA如何、Pcf11是如何參與聚腺苷酸化反應進行poly(A)的位點選擇的。相信通過構建轉錄終止因數Pcf11等缺失菌株,利用高通量方法深入分析轉錄終止因數與終止子的結合位點和規律,將會進一步實現在全基因組層面分析轉錄終止過程的詳細調控網絡,為轉錄終止機理提供新的研究線索。

2.2依賴於poly(A)位點的轉錄終止

真核生物的遺傳資訊由三種聚合酶進行轉錄,作用於不同類型的轉錄本,RNA聚合酶II轉錄大量mRNA和一些經典的非編碼功能基因SnoRNA和SnRNA,這些轉錄產物的生物合成是一個嚴格調控過程,與其他RNA加工事件共同進行。對於蛋白質編碼基因,轉錄終止主要依賴於poly(A)位點的終止路徑,與切割和聚腺苷酸化因數相關。在真核生物中除了組蛋白mRNA幾乎絕大多數真核生物mRNA和lncRNA的3′末端都具有一串連續的腺苷,被稱為poly(A)尾巴。poly(A)尾巴與mRNA的出核轉運、穩定性和翻譯效率息息相關,具有重要的生物學意義。

研究表明,絕大多數的mRNA具有一個或兩個以上的多聚腺苷酸化位點,酵母、哺乳動物、擬南芥高達70%以上基因具有選擇性多聚腺苷酸化現象,在3′末端加工中具有重要作用,並受到複雜而精細的調控,涉及到許多蛋白質-RNA之間的相互作用。這種相互作用可分為兩種情况:一種擁有多個poly(A)位點,並且都在3′-UTR區對應的mRNA編碼區完全一樣,只是3′-UTR長短不同稱為UTR-APA;一種是由選擇性切割導致,poly(A)位點位於不同的外顯子區域編碼序列有可能發生改變,稱為CR-APA。在此過程中,貫穿整個轉錄過程的轉錄終止因數Pcf11作為“加工支架”,能够輔助CPF識別poly(A)位點的側翼元件,有助於切割因數在poly(A)位點的準確切割,輔助蛋白質複合物與pre-mRNA的穩定結合,有助於mRNA在蛋白質合成中有效地發揮作用。可以看出,poly(A)位點選擇性多聚腺苷酸化會直接影響到mRNA的穩定性和翻譯效率。

poly(A)位點位於整個轉錄本的3′末端,位點的選擇直接影響到mRNA最重要的調控區3′-UTR,是絕大多數RNA結合蛋白和microRNA調控的靶標區域,囙此poly(A)位點的選擇會直接影響到mRNA的穩定性和翻譯效率。然而,酵母中選擇性多聚腺苷酸化的具體調控機理尚不明確,對其具體分子機制及功能性結果等尚處於研究的起步階段。認為多聚腺苷酸化過程通常與終止子序列具有內在聯系,終止子元件上的ploy(A)位點與多聚腺苷酸化反應必需的蛋白質複合物的識別密切相關,其中3′末端的切割和多聚腺苷酸化是兩個重要的步驟。pre-mRNA切割和聚腺苷酸化是一種機制,令編碼蛋白mRNA和長鏈非編碼RNA的3′末端中斷。該過程涉及大量多聚腺苷酸化因數與終止子功能元件之間的相互作用,其中ploy(A)位點的準確切割取決於切割和多聚腺苷酸化因數CPF蛋白質複合體,識別終止子區域內的ploy(A)位點、富含GU/U的側翼元件,促進ploy(A)位點的多聚腺苷酸化反應過程。

2.3不依賴poly(A)位點的轉錄終止途徑

與蛋白質編碼基因的轉錄終止相比,釀酒酵母大部分非編碼轉錄事件不依賴於RNA切割終止,而是需要Nrd1-Nab3-Sen1蛋白複合物途徑終止。該途徑包括大多數小核仁RNA、隱形不穩定轉錄本等。非編碼蛋白Nrd1、Nab3在全基因組上的靶標RNA序列研究較為清楚,通過與RNA聚合酶II的亞基Rbp1和終止子區域中的GUA/G核苷酸相互作用,分別識別UGUAG/A和UCUUG,其中Nrd1還可以通過促進過早轉錄終止來調控數百種蛋白質編碼基因,這些靶標RNA序列在SnoRNA序列中是頻繁的,特定的RNA基序對於Nrd1-Nab3-Sen1蛋白複合物結合到新生的RNA上是至關重要的。

3釀酒酵母終止子的人工設計與合成

釀酒酵母可以利用自身有效的同源重組在體內進行遺傳電路或合成途徑的組裝,但當外源基因序列與酵母基因組序列重複或高度相似時,會給多基因裝配帶來問題。大多數天然終止子的序列較長,作為元件使用時與酵母基因組同源重組的風險較大,可能會導致體內組裝構建物中重複序列的重排,在構建大型遺傳回路或途徑時較為困難,同時過長或太複雜的終止子也會影響异源基因mRNA的穩定性和翻譯效率,降低表達水准。為了避免這些不足,終止子工程應運而生。終止子設計的基本原則是,採用最少元素設計,將功能元件的最佳序列組合在一起,對天然終止子序列進行簡化,合成人工終止子,不僅使其具有與天然終止子相同的效應,由於其與酵母基因組幾乎沒有同源性,大大降低了同源重組率,還能大幅度縮短終止子長度,減輕質粒載體和菌株代謝負荷。

終止子設計是沿著相對較短的線性DNA進行模組化組合的,可以創建高度精確的基因表達模式。從頭合成終止子的設計將提供比天然終止子更大的優勢,就像合成啟動子可以勝過天然啟動子一樣,合成終止子可能同時影響多個mRNA特性,即多聚腺苷酸化水准和3′-UTR區域的結構。為了構建一系列合成的終止子,可從基礎元件、間隔區、二級結構、GC含量等方面設計(圖3)。Curran等基於構成終止子結構的基礎元件,設計出30個短的、合成長度為35~70 bp的人工終止子,與常用的CYC1終止子相比,合成的短終止子更能提高mRNA的穩定性和新增蛋白質產量,其中人工終止子最高使螢光蛋白輸出新增3.7倍,轉錄水准新增4.4倍,並且合成的終止子在釀酒酵母和解脂耶氏酵母中都具有很高的活性,證明了這些設計理念可在多種酵母菌種中轉移。

圖3酵母終止子設計的思路

(a,b,c表示用RNA fold軟件呈現出不同的莖環結構)

表達增强型終止子使釀酒酵母基因表達效率比對照提高了11倍,與不使用終止子情况相比提高了35倍,為今後終止子人工設計提供了理論依據和設計規則:如螢光蛋白的表達量與效率元件的序列長度成正比;位置元件和poly(A)位點對螢光蛋白的表達量沒有太大影響。本課題組在優化效率元件、位置元件和poly(A)位點基礎方面,進一步探討了間隔區序列對終止子活性的貢獻。在Guo首次描述定義酵母終止所需最小元素集的基礎上,通過構建266個長度約60 bp的人工終止子文庫,初步發現了一些規律:終止子活性隨效率元件與位置元件間Linker 1序列GC含量的升高而降低,且隨Linker 1序列中T的新增而新增;Linker 1序列GC含量對螢光蛋白表達量的影響要大於Linker 2序列;Linker 2序列構成的莖環對不同活性終止子具有不同程度的影響,降低弱、中等强度終止子的莖長有利於提高mRNA表達量和蛋白質產量。這些研究充分證明終止子的活性是可以調節可以控制的,更短、最小序列的終止子可能被編入未來基因調控元件的設計和預測模型中,也將為理解終止子在基因表達調控中的作用提供重要資訊。錶1列舉了常用酵母終止子的相關資訊。

錶1常用酵母終止子的資訊

4終止子在酵母途徑精細調控中的應用

儘管利用强啟動子控制途徑酶的表達是代謝工程和合成生物學中常用的調控方法,但隨著對轉錄終止過程的逐步解析,終止控制已經受到越來越多的關注。由於終止子有助於mRNA穩定,將天然終止子用於基因表達盒構建是構建外源途徑的必然選擇。而使用合成的人工終止子可以更加理性地調控mRNA的半衰期,减少或新增蛋白質產生,囙此通過選擇合適活性的終止子可以對代謝途徑進行精細調控。利用終止子優化合成途徑時,可考慮以下原則:①儘量選擇相對較短的終止子,以避免冗餘序列帶來的干擾;②選擇終止子時要同時考慮相應組成型啟動子的活性,弱、强元件的搭配可以達到使用高活性啟動子的效果;③使用誘導性啟動子時,終止子的調控作用將會明顯降低,囙此只需考慮終止子是否易得、易操作;④若難以判斷某一基因對多基因途徑的影響時,可優先考慮使用中等活性終止子,既能保證目的基因的有效表達,又能有效避免途徑上游基因對下游基因的干擾。例如,本課題組通過優選天然終止子來控制番茄紅素合成途徑,結合檸檬酸分批補料發酵使釀酒酵母合成番茄紅素的產量獲得了大幅提升,在此基礎上,利用短的、人工合成的終止子控制番茄紅素途徑基因的表達,使番茄紅素產量又提高了13.0%,並發現在某些情况下中等活性終止子比强終止子更有利於代謝途徑表達。當合成終止子用於較長途徑的β-香樹脂醇合成時,也表現出了良好的效果,使β-香樹脂醇產量提高了約12倍。現時,已在酵母中建立了大量的天然終止子文庫,同時部分結構優化的人工終止子元件已應用於代謝途徑調控中,它們的調控能力較天然終止子有顯著提高,在代謝工程中具有極大的潜力。這些實例充分證明了終止子調控科技在控制代謝途徑中的重要作用,不僅能够用於調節基因表達效率,還可以有效增强代謝途徑中目標產物的產量。

5結語與展望

合成生物技術突破了生命發生與進化的自然法則,推動了生命科學由解讀生命到編寫生命的跨越,將在破解資源、能源、健康、環境、安全等重大難題方面提供重要支撐。過去的一段時間裏,啟動子、終止子等調控元件的研究為提升基因和途徑的表達給予了許多貢獻。然而,偏離期望的元件功能仍然是導致設計週期多次反覆運算、遺傳改造和途徑優化快速發展的嚴重阻礙。穩定、正交、可預測、可調的元件設計是優化控制元件功能必須滿足的要求,控制元件的最小化已成為趨勢。迄今為止,人們對終止子結構與功能、作用機理的探索取得了重要進展,新的合成終止子已經為代謝工程和合成生物學應用提供了重要支持。但由於真核細胞終止子受其所在染色質環境的高度調控,對酵母終止子的工程化努力仍然較少。終止子與各類轉錄終止因數如何識別、識別位點或序列是什麼,這些問題仍然是終止子優化設計的限制。囙此,有必要進一步製定控制終止子染色質環境的設計規則,開發新技術來預測和設計期望功能的終止子。

為避免野生型酵母染色質環境對終止子研究的干擾,利用人工合成酵母體系研究人工設計終止子的特性和調控機理將會是一種重要的科技選擇。另外,新一代高通量測序科技為研究終止子轉錄機理注入了巨大的活力,是研究轉錄機理的新的發展趨勢。如紫外交聯免疫沉澱測序、染色質免疫沉澱測序科技可為終止子元件與蛋白質的結合靶點提供服務;多聚腺苷酸化位點測序科技將為多聚腺苷酸化反應機理研究發揮積極作用。

另外,巴斯德畢赤酵母、多形漢遜酵母、解脂耶氏酵母等非模式酵母近年來也展現出了優良的工業應用價值,通過構建文庫等方法在這些酵母中也篩選到了一些內源終止子。儘管非模式酵母中終止子研究較少,但終止子是重要的合成生物學元件之一,是構建基因表達盒和途徑的基本要素,囙此非模式酵母中終止子的篩選、人工構建甚至异源終止子的優化等也將會是今後該領域的研究重點。相信通過終止子等元件的逐漸解析和開發,會彌補非模式酵母遺傳背景不够清楚、代謝調控複雜性高的限制,必將為非模式酵母合成生物學的發展帶來新突破。

本文標題: 《合成生物學》精選文章,|,酵母終止子工程,從機理探索到人工設計
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相关資料
Jay,Keasling組和John,Hartwig組等合作Nat,Chem,|,工程化微生物綜合人工酶用於構建人工生物合成路徑
合成生物學利用微生物宿主生產來源於稀有或難以培養生物體中的複雜分子,但這些分子結構僅限於由天然酶催化形成。本文將合成生物學和合成化學綜合為人工生物合成相關研究提供範例。
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上海光機所實現高諧波效率高填充係數的重頻皮秒紫外雷射輸出
高功率紫外雷射在雷射預處理、微納加工、量子光學和非線性光學量測等領域有著廣泛的應用需求。對於重頻亞納秒和皮秒紫外雷射器來說,由於缺乏精確的時空調製,三倍頻轉換效率通常低於50%。囙此需要提高雷射脈衝的時空填充係數,使雷射脈衝在時間和空間上各
標籤: 上海光機所 諧波 皮秒 皮秒雷射 科普 倍頻
葉明新教授、沈劍鋒教授、劉建軍教授,NC觀點,調節亞穩相鉬酸鎳的活性電子態並應用在大電流產氫
電化學產氫作為一種新興的能源科技備受關注,而其中的電催化劑是至關重要的一環。在自然界中,非貴金屬過渡金屬氧化物以鉬酸鎳為例儲量豐富,價格便宜,具有很大的潜力應用在未來的工業化中。但是其本身較差的導電性和本征活性限制了其在催化領域的進一步發展
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南京天光所LAMOST,DR7數据集向全世界公開發佈
按照國際天文界慣例及《LAMOST光譜巡天數據政策》,2021年9月底,包含LAMOST先導巡天及正式巡天前七年的光譜數據——DR7數据集對全世界公開發佈。LAMOSTDR7光譜數據獲得於2011年10月至2019年6月共八年的巡天觀測。L
標籤: 光譜分辯率 光譜 lamost