遇見-背景
藥物在人體肝臟內能够被不同亞型的細胞色素P450酶代謝產生多種藥物代謝產物(human drug metabolites),從而改變母藥的活性、毒性、穩定性、水溶性以及生物利用度,囙此藥物代謝產物是藥物開發過程所涉及藥理學、藥代動力學、藥效學和毒理學研究中不可缺少的化學標準品物質。然而,這些在體內經由P450酶催化反應產生的代謝產物,往往具有高度的區域/立體選擇性,通常難以通過化學方法直接合成;而人源P450酶由於其膜蛋白的性質,限制了其在异源宿主中的表達和應用;囙此開發具有類人源P450酶功能的生物催化劑成為解决這一問題的有效途徑。在先前的研究中,源於巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的脂肪酸氧化酶P450 BM3一直被作為潜在的生物催化劑原型進行研究,然而由於BM3結構中細長底物結合口袋的限制,天然的BM3並不能直接識別結構較大的藥物分子,需要通過酶工程、定向進化等手段對其催化口袋進行改造,而該過程往往費時費力、效率不高。圖片圖片
遇見-內容
近日,山東大學微生物科技國家重點實驗室李盛英教授課題組,發現鏈黴菌來源的P450酶PikC能够高效地催化氮烷基藥物分子轉化為相應的藥物代謝產物。相關研究結果以“Bacterial Biosynthetic P450 Enzyme PikCD50N: A Potential Biocatalyst for the Preparation of Human Drug Metabolites”為題,發表於有機化學領域權威期刊《The Journal of Organic Chemistry》。碩士研究生郭嘉偉為論文第一作者,張興旺助理研究員為論文通訊作者。
PikC是源自委內瑞拉鍊黴菌(Streptomyces venezuelae)苦黴素(pikromycin)生物合成途徑中的可溶性P450羥化酶,其天然功能是催化12/14-元大環內酯底物YC-17/narbomycin的羥基化。前期的結構生物學研究發現,底物結構中的氮二甲基基團能够和PikC催化口袋中特定位置的酸性胺基酸形成鹽橋,從而使催化位點接近PikC的“血紅素-鐵”催化中心完成反應,這一特殊的“錨定”機制對PikC的底物識別和催化選擇性至關重要(J. Biol. Chem. 2006,281,26289;2009,284,5723)。隨後的底物工程研究發現,能够通過將天然或化學合成的氮二甲基基團連接於非天然底物從而實現PikC的催化(圖1. P. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009,106,18463;J. Am. Chem. Soc. 2014,136,4901;Nat. Chem. 2015,7,653)。
圖1:PikC“底物工程”策略的進化
本研究受到PikC-底物相互識別機制及底物工程進化歷程的啟發,選擇了19種具有不同治療作用和結構類型,但結構中同時含有氮二烷基基團的臨床藥物,與先前構建的高催化活性突變體PikCD50N進行體外反應,結果發現PikCD50N能够將其中的15種藥物(化合物1-15,圖2)轉化為多種代謝產物。通過HR-MS,NMR,GC-MS和HR-MS/MS對產物結構進行鑒定,發現PikCD50N催化藥物分子的反應具有多樣化的反應類型,包含羥基化、連續氧化、去N-烷基化、N-氧化、S-氧化和二聚化等。通過產物結構比較,發現PikCD50N的代謝產物與人體肝臟P450酶催化產生的人體藥物代謝產物具有極高的覆蓋度和相似性(所鑒定的55種產物中有45種產物結構與人體藥物代謝產物結構一致)。
圖2:本研究中使用的藥物分子化學結構(氮烷基基團以藍色突出顯示)。
隨後,作者以PikCD50N催化的中樞神經系統藥物氯丙嗪(Chlorpromazine,1)代謝反應為模型,探究了不同還原伴侶對產物分佈的影響(圖3),發現不同的還原伴侶能够改變PikCD50N的產物譜,說明還原伴侶在藥物代謝產物製備中能够發揮“調節器”作用,用於選擇性製備不同產物。值得一提的是,低成本的H2O2也能够高效地支撐PikCD50N催化藥物分子的代謝反應,從而避免了複雜還原伴侶系統及昂貴輔因數NADPH的使用(圖3)。此外,酶動力學研究發現,PikCD50N對1的催化效率(kcat/Km = 1.59±0.92μ.-1min-1)甚至遠高於其天然底物YC-17(0.24μM-1min-1)。為了驗證PikCD50N作為生物催化劑製備藥物代謝產物的可行性,作者於100–200 mL的放大反應體系中進行了PikCD50N-1反應,結果發現PikCD50N在放大反應體系中能够維持原來的催化效率和產物分佈,通過製備HPLC的分離純化,順利得到了毫克級別的多種藥物代謝產物。
圖3:不同還原伴侶和H2O2支撐PikCD50N-1反應HPLC分析結果。
最後,作者通過蛋白分子對接實驗結合P450酶的催化機理,對PikCD50N-1反應產物多樣性的產生機制進行了探討。蛋白結構比較發現,與P450 BM3相比,PikCD50N具有與人體肝臟中藥物代謝主要亞型P450 3A4更為相似的底物結合口袋(圖4),預示著PikCD50N是更具天然優勢的生物催化劑開發模型。
圖4:PikCD50N-1分子對接實驗(上圖)和PikCD50N/BM3/3A4底物結合口袋(高亮顯示)比較。
本研究首次發現來源於鏈黴菌生物合成途徑中的P450酶PikCD50N具有類人源P450酶催化功能,並且PikCD50N催化藥物代謝反應擁有可塑性强、成本低、催化效率高、底物範圍廣等優點,具備在藥物工業中的實際應用潜力。本研究也為今後PikC及其它生物合成P450酶新功能的開發提供了借鑒。