近日，華中農業大學動物科學技術學院、動物醫學院苗義良團隊與生命科學技術學院陳振夏團隊合作揭示了猪尅隆胚胎發育過程中組蛋白甲基化H3K9me3、H3K27me3以及DNA甲基化的重程式設計障礙，以及克服上述重程式設計障礙並促進猪尅隆胚胎發育的兩種新方法。研究成果以“TDG is a pig-specific epigenetic regulator with insensitivity to H3K9 and H3K27 demethylation in nuclear transfer embryos”為題在Stem Cell Reports發表。
近年來，伴隨CRISPR/Cas9基因精確編輯體系的發展，克隆技術在猪分子育種上的應用潜力逐漸顯現，一批與優勢經濟性狀和抗病性狀相關的尅隆猪模型被紛紛創制。而由於猪和人類生理結構的相似性，尅隆猪模型還可應用於人類器官再造和疾病病理研究，這都反映出猪克隆技術在農業育種和生物醫學領域存在巨大的應用前景。非瘟疫情影響下，克隆技術還能應用於地方種、引進種和新培育猪品種的種質資源保存。
不過自複製羊“多莉”誕生以來，哺乳動物尅隆胚胎早期發育的高損率（尅隆囊胚率僅10-15%，受精囊胚率可達30-80%）和極低的出生效率（尅隆動物約1-2%，受精動物可達40-60%）一直是限制尅隆技術推廣應用的瓶頸問題。現時的主流觀點認為，受體卵母細胞對供體細胞基因組存在天然的重程式設計障礙，導致尅隆胚胎出現錶觀遺傳修飾的异常富集和相應基因的异常表達，而尋找克服重程式設計障礙的有效方法一直是突破猪尅隆技術應用壁壘的研究熱點。
本研究首次結合近年來開發的低細胞量轉錄組測序（Smart-seq）科技，從全基因組層面鑒定了猪尅隆胚胎在合子基因組啟動階段（4細胞期）异常表達的基因和基因組區域。同時，利用低細胞量的全基因組DNA甲基化測序（PBAT-seq）和染色質免疫共沉澱測序（ULI-NChIP-seq）科技，確定了上述异常表達的基因啟動子和基因組區域中存在高水准富集的DNA甲基化和組蛋白甲基化H3K9me3、H3K27me3。最重要的是，針對這些重程式設計障礙，該研究開發了兩項有效提高猪尅隆胚胎發育能力的新方法：1）聯合使用顯微注射科技在尅隆胚胎中過表達H3K9me3的去甲基化酶KDM4A，並向胚胎培養液中添加H3K27me3編寫酶抑制劑GSK126；2）使用誘導表達與DNA去甲基化相關的胸腺嘧啶糖基化酶TDG的供體細胞株構建尅隆胚胎。上述克服途徑均不同程度地調整了猪尅隆胚胎基因和基因組區域的异常表達，並最終使尅隆胚胎的囊胚率提高近兩倍。
猪尅隆胚胎在合子基因組啟動階段的重程式設計障礙和克服途徑
華中農業大學動科動醫學院副研究員劉鑫和王濤博士、生命科學技術學院陳露博士後為論文的共同第一作者，華中農業大學苗義良教授和陳振夏教授為論文通訊作者。本研究受到了國家重點研發計畫和國家自然科學基金的資助。
【英文摘要】
Pig cloning by somatic cell nuclear transfer（SCNT）frequently undergoes incomplete epigenetic remodeling during the maternal-to-zygotic transition，which leads to a significant embryonic loss before implantation.Here，we generated the first genome-wide landscapes of histone methylation in pig SCNT embryos.Excessive H3K9me3 and H3K27me3，but not H3K4me3，were observed in the genomic regions with unfaithful embryonic genome activation and donor-cell-specific gene silencing.A combination of H3K9 demethylase KDM4A and GSK126，an inhibitor of H3K27me3 writer，were able to remove these epigenetic barriers and restore the global transcriptome in SCNT embryos.More importantly，thymine DNA glycosylase（TDG）was defined as a pig-specific epigenetic regulator for nuclear reprogramming，which was not reactivated by H3K9me3 and H3K27me3 removal.Both combined treatment and transient TDG overexpression promoted DNA demethylation and enhanced the blastocyst-forming rates of SCNT embryos，thus offering valuable methods to increase the cloning efficiency of genome-edited pigs for agricultural and biomedical purposes.
論文連結：
https://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711（21）00489-6