Science,Advances,|,復旦大學丁琛/賀福初使用生物素化轉座子對可及染色質上的轉錄機器進行全蛋白質組分析

儘管在檢測開放染色質區域的基因組測序策略方面取得了巨大進步,但構建功能性DNA-蛋白質轉錄機器的蛋白質複合物仍然未知。基因組和蛋白質組解析的不平衡阻礙了研究人員對轉錄調控的理解;然而,到目前為止,還沒有蛋白質組規模的方法來檢測與開放染色質結合的蛋白質複合物。

來源:iNature(ID:Plant_ihuman)

儘管在檢測開放染色質區域的基因組測序策略方面取得了巨大進步,但構建功能性DNA-蛋白質轉錄機器的蛋白質複合物仍然未知。基因組和蛋白質組解析的不平衡阻礙了研究人員對轉錄調控的理解;然而,到目前為止,還沒有蛋白質組規模的方法來檢測與開放染色質結合的蛋白質複合物。

2021年10月22日,復旦大學丁琛,賀福初及上海交通大學Yang Wenjun共同通訊在Science Advances線上發表題為“Proteome-wide profiling of transcriptional machinery on accessible chromatin with biotinylated transposons”的研究論文,該研究為了直接和定量地識別組裝在可接近染色質上的轉錄蛋白複合物,該研究開發了一種基於生物素化接頭直接轉座到開放染色質中的質譜(ATAC-MS)檢測轉座酶可接近的染色質。

ATAC-seq與啟動的基因序列資訊相結合,ATAC-MS分析可接近的染色質-蛋白質機器。ATAC-MS與fractionation策略(fATAC-MS)相結合,可以提供高解析度的染色質轉錄機器圖譜。具有新型Tn5-dCas9融合蛋白的ATAC-MS[dCas9靶向ATAC-MS(ctATAC-MS)]進一步促進了對特定開放染色質區域轉錄機器的系統定位。該研究使用ATAC-MS和ATAC-seq研究了C2C12細胞分化過程中的轉錄調控,並證明了RFX1在調節C2C12細胞增殖和分化中的作用。該研究策略提供了一個通用工具箱,包括ATAC-MS、fATAC-MS和ctATAC-MS,這使研究人員能够描繪基因組規模的轉錄調控機器圖譜,並研究特定基因組位點的蛋白質-DNA複合物。

基因轉錄由DNA-蛋白質相互作用精確控制。真核基因組被分層包裝到染色質中,染色質在調節基因表達中起著核心作用。動態染色質可及性變化反映了决定細胞和組織命運的時間和空間轉錄模式。在基因組學領域,有許多有用的測序方法可通過使用陽性和陰性轉錄標記評估基因組佔用,來檢測染色質可及性。例如,H3K4Me3和H3K27Ac的染色質免疫沉澱(ChIP)可用於定義基因組的活性區域,而H3K27Me3的ChIP可用於精確定位基因抑制區域。

開放染色質區域也可以通過轉錄因數(TF)或核小體佔據的基因組區域的測序來推斷。微球菌核酸酶消化(MNase-seq)靶向並繪製總核小體群以間接預測開放染色質區域;去氧核糖核酸酶I-超敏位點測序(DNase-seq)和甲醛輔助的調節元件分離與測序(FAIRE-seq)可用於對TF佔據的DNA進行測序並直接繪製開放染色質。儘管上述策略在研究中得到廣泛應用,但仍存在靈敏度低和資料需求高的缺點。由於其高靈敏度和穩健性,ATAC-seq已成為一種流行的科技,並已廣泛應用於生物學研究。

儘管在檢測開放染色質區域的基因組測序策略方面取得了巨大進步,但構建功能性DNA-蛋白質轉錄機器的蛋白質複合物仍然未知。基因組和蛋白質組解析的不平衡阻礙了研究人員對轉錄調控的理解;然而,到目前為止,還沒有蛋白質組規模的方法來檢測與開放染色質結合的蛋白質複合物。

以前,研究人員開發了一種在蛋白質組尺度上識別內源性TF的方法,該方法使用合成DNA來富集TF,該方法包含串聯的共有TF響應元件(TFRE)的串聯陣列。TFRE方法結合尖端的質譜(MS)科技能够在蛋白質水准上實現深入的TF和轉錄共調節(TC)覆蓋。然而,它不能用於實时檢測體內開放染色質結合蛋白複合物,因為它需要將核提取物與人工TFRE-DNA誘餌進行體外孵育。

轉錄蛋白機器可以通過RNA-seq方法通過轉錄組的量化來間接推斷,以預測上游TFs/TCs的存在和動態。預測轉錄蛋白機器的更準確策略涉及集成的ATAC-seq和RNA-seq分析。ATAC-seq提供有關開放染色質上潜在TF/TC DNA結合基序的資訊,RNA-seq提供有關潜在TF/TC下游靶基因(TG)表達豐度的資訊。大多數TFs/TCs不能僅通過DNA/RNA序列的預測來揭示。迫切需要一種直接方法來確定蛋白質機器與開放染色質的原位結合,以研究所涉及的蛋白質和轉錄調控機器。

在這裡,該研究報告了使用生物素化轉座子對可接近染色質的轉錄機器進行全蛋白質組分析的結果。該研究使用高活性轉座子5(Tn5)轉座酶將生物素化接頭加載到活性調節元件上。用鏈黴親和素珠純化可接近的染色質的蛋白質-DNA複合物,使研究人員能够直接並行檢測蛋白質機器(通過ATAC-MS)和佔據的開放染色質區域(通過ATAC-seq),全面描述轉錄機器蛋白質組學和基因組資訊。

該研究監測了由腫瘤壞死因數-α(TNF-α)誘導的核因數κB(NF-κB)家族和下游TG的啟動,證明了ATAC-MS用於跟踪TF動力學的可行性。該研究還觀察到雌激素受體1(ESR1)與受17β-雌二醇(E2)和4-羥基三苯氧胺(4-HT)調節的共啟動劑和共阻遏物的組裝,證明了ATAC-MS描述TC景觀的獨特能力。該研究接下來使用dCas9靶向ATAC-MS(ctATAC-MS)和E-box單向導RNA(sgRNA)在小鼠肝臟晝夜節律模型中研究了靶向增强子盒(E-box)DNA序列的蛋白質調節機器。最後,該研究使用ATAC-MS來研究C2C12細胞分化過程中的轉錄調控機器。TF調節因數X1(RFX1)被鑒定並證明可以調節C2C12細胞的增殖和分化。

參考消息:

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abh1022#con13

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