近日，出現於南非的新冠病毒變異株Omicron（B.1.1.529）引發了全球前所未有的關注和擔憂，多國對南部非洲國家實行班機禁入，有專家稱Omicron是“最糟糕的變異株”，現有疫苗對Omicron的效力還在觀察之中。我們仍然面對著新冠的威脅。
除了推廣疫苗的接種之外，積極推動各類抗病毒療法的發展也是應對疫情持續擴散的重要舉措。而當下可供感染者選擇的治療方案十分有限，迫切需要新型的特异性療法，特別是口服藥物，來預防更嚴重的感染、住院和死亡。同時，對患者及時有效的治療也可以縮短傳染期，降低福斯患病風險。
撰文|汪汪
自新冠疫情暴發開始，人們就一直在曾經獲批的藥物中尋找有效的抗病毒藥物，迄今為止，針對新冠病毒的小分子研究，已有超過500條藥物研究數據以及400多項臨床試驗，其中絕大多數研究對象為已準予的藥物，可惜老藥新用的收效甚微，並沒有出現令人滿意的結果。雖然吉利德公司（Gilead）開發的瑞德西韋（Remdesivir）顯示了一定的療效，但是因為需要靜脈給藥，限制了其早期應用，在需要住院的病人中療效有限（詳見《“人民的希望”尚未成真：瑞德西韋仍待驗證》）。還有一些新型的口服藥物已經取得積極的臨床試驗結果或者正在進行臨床實驗，比如作用於病毒RNA聚合酶的核苷類藥物莫那匹韋和AT-527[1]。
2021年11月5日，輝瑞公司（Pfizer）公佈了其研發的新冠口服藥物Paxlovid的三期臨床研究結果，顯示輕中度新冠患者在確診三天內服用該藥，其住院或死亡風險可降低約89%。Paxlovid的表現可以媲美新冠中和抗體的治療效果，也顯著優於前幾日在英國獲批上市的默沙東公司研發的廣譜抗病毒藥物莫那匹韋（Molnupiravir）。這一消息引起了人們的廣泛關注，有媒體稱Paxlovid為對付新冠感染的“銀色子彈”（silver/magic bullet）。
新冠病毒的刺突蛋白仍在不斷變異，令世界不得安寧。“銀色子彈”能為人類打破這片可怖的陰影嗎？
答案，可能藏在這款小分子抗病毒藥物的研發歷程中。
撥開迷霧，尋找可成藥靶點
在新冠病毒出現以後，科學家們以非常快的速度解析了病毒的基因序列以及結構，為後續疫苗的設計和抗病毒藥物的研發打下了堅實的基礎。現在我們知道，新冠病毒是一種具有包膜的單正鏈RNA病毒，如圖1所示，它由病毒RNA和四種結構蛋白組成：
圖1 SARS-CoV-2及其結構蛋白示意圖[2]
①刺突蛋白（Spike protein，S）主要負責與宿主細胞受體結合，介導病毒的入侵；
②包膜蛋白（Envelope，E）
③膜蛋白（Membrane protein，M），包膜蛋白和膜蛋白主要參與病毒複製裝配和出芽過程；
④核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，N）包裹病毒基因組，形成核蛋白複合體。
在病毒進入宿主細胞後，它會分解釋放出病毒RNA，病毒RNA借由宿主細胞中的核糖體翻譯成為兩條多聚蛋白pp1a和pp1ab，這兩條多聚蛋白就像是整盒包裝的拼圖，還不能發揮作用，需要在3CL蛋白酶和PL蛋白酶作用下拆裝再重組，以形成具有功能的結構蛋白。用專業的話說，就是蛋白酶催化完成分子內水解，切割產生多個非結構蛋白，組成複製-轉錄複合物，以完成後續基因組的複製和結構蛋白的合成過程（圖2）。
圖2 SARS-CoV-2感染宿主細胞迴圈示意圖[2]
在這個過程中，3CL蛋白酶（3C-like protease）負責多聚蛋白11個位點的切割，以產生對病毒生存、繁殖非常重要的結構蛋白，囙此又被稱為主蛋白酶（Mpro）。我們可以設想，如果我們設計的小分子藥物可以抑制3CL蛋白酶的活性，那我們就可以干擾病毒複製過程，達到抗病毒的效果[2]。科學家們當然也想到了這一點，囙此當前對3CL蛋白酶抑制劑的研究非常熱門。
過去，針對其他病毒進行小分子藥物設計時，病毒蛋白酶也是非常重要的靶點。比如治療人類免疫缺陷（HIV）和丙型肝炎（HCV）病毒的小分子口服療法都曾以蛋白酶為靶點進行藥物研發[3]。此外，最近的研究證明了口服3CL蛋白酶抑制劑在SARS-CoV-2感染的轉基因小鼠模型中的藥理活性[4]。這些都證明，3CL蛋白酶抑制劑具有非常大的潜力，可以成為抗病毒藥物。
2020年4月，楊海濤、饒子和團隊報導了新冠病毒3CL蛋白酶與其抑制劑N3的晶體結構[5]。該蛋白酶為同源二聚體，每個單體由三個結構域組成（圖3），在結構域Ⅰ和結構域Ⅱ之間形成底物結合口袋，底物結合口袋中，Cys-145和His-41形成催化二聯體，能够結合並切割多聚蛋白。
圖3.SARS-CoV-2 3CL蛋白酶與抑制劑N3的晶體結構[5]
3CL蛋白酶在不同屬冠狀病毒間高度保守，在人體內沒有同源蛋白。這意味著將其作為藥物靶點進行抑制劑設計，不太可能“誤傷”其他蛋白，可以達到較高的安全視窗或者治療指數。
總的來說，由於3CL蛋白酶在病毒生存與繁殖過程中起著關鍵作用，而且與已知的人體內的蛋白酶沒有顯著的同源性，囙此其抑制劑具有較好的選擇性與安全性預期。並且，它不像疫苗或單克隆抗躰藥物那樣，無法預防刺突蛋白的變體（新冠病毒的變異株層出不窮且具有極大威脅性），新冠病毒的3CL蛋白酶抑制劑已經成為非常有潜力、且具有代表性的小分子抗病毒藥物設計思路，可用於設計抗病毒口服藥物，治療COVID-19。
從SARS到SARS-CoV-2
2002年，SARS暴發。為應對疫情，輝瑞公司基於過去的工作研發出了化合物PF-00835231（圖4）。在探索這個化合物抗SARS-CoV-1的機制時，科研人員採用基於螢光共振能量轉移（FRET）的底物裂解實驗，將其篩選確定為SARS-CoV-1的3CL蛋白酶抑制劑。不過，SARS來得快去得快，隨著2003年非典疫情結束，PF-00835231的研發計畫就此擱淺[6]。
2020年初，新冠疫情在全球暴發，肆虐至今。大量的研究表明，引起新冠病毒病COVID-19的罪魁禍首SARS CoV-2與2002年引起SARS的SARS CoV-1具有密切的相關性——兩種SARS冠狀病毒基因組都編碼兩個重疊的多聚蛋白，在對冠狀病毒複製至關重要的翻譯後加工步驟中，它們在特定位點都被3CL蛋白酶切割。更為重要的是，而這兩種病毒的3CL蛋白酶在與底物結合的催化域中的序列100%相同，這意味著對SARS-CoV-1 3CL蛋白酶有抑制作用的小分子對SARS-CoV-2 3CL蛋白酶應該也有抑制作用。
於是，輝瑞重新撿起化合物PF-00835231，推測其對SARS-CoV-2的3CL蛋白酶也具有很好抑制效果。後續的研究結果證實了輝瑞科學家們的猜想，PF-00835231表現出對SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的強效抑制效果（抑制常數（Ki）= 0.271 nM）。
圖4.SARS-CoV-2 3CL蛋白酶抑制劑的體外和體內參數。從左到右分別為3CL蛋白酶活性Ki、抗病毒活性EC50、通透性Papp、內在清除率CLint、血漿清除率CLp、口服生物利用度F和從胃腸道吸收的口服劑量的分數（Fa x Fg）。[7]
如圖4的數據第一行所示，PF-00835231具有優良的抗病毒活性和代謝穩定性，但其滲透性和口服利用度較低，囙此很難進行口服給藥，現時PF-00835231的臨床實驗在採用它的磷酸鹽前藥形式（PF-07304814）作為COVID-19住院患者的靜脈治療選擇[8]。
化合物改造
為了開發出適合口服的藥物，輝瑞開始對化合物PF-00835231進行改造[7]。
一開始，我們先將PF-00835231稱為“化合物1”。
科研人員首先考慮的是改善分子口服生物利用度，也就是提升藥物進入體循環的程度。由於氫鍵供體較多往往會導致口服生物利用度較差，囙此科研人員首先將化合物1的α-羥甲基酮改為氰基，得到化合物2；又在2的基礎上同時引入氮雜雙環和苯並噻唑，得到化合物3。
此時，相較於化合物1而言，2的口服利用度和胃腸道吸收的口服劑量分數都有了顯著提高；化合物3的被動吸收滲透性也明顯增强，但2，3的抗病毒活性相較於1又都有明顯下降。
從分子與蛋白的結合模式分析可以看出（圖5C），化合物3有效地填充了由Met49、Met165和His41形成的親脂性口袋，但不能與Gln189形成有效的氫鍵（如圖5C所示），同時導致其活性遠不如1。而且與化合物1相似，研究人員觀察到這兩個分子中的吲哚片段並沒有很好地佔據口袋。
囙此研究人員進一步對3進行了結構改造，將吲哚片段改為甲基磺醯胺結構，得到了化合物4。相對於1和3，4可以與Gln189和Glu166都形成氫鍵，表現出更好的蛋白結合力、抗病毒活性和口服吸收效果。
圖5.（A）SARS-CoV-2-3CL蛋白酶與化合物1的共晶結構。（B）化合物3的雙環模型與脯氨酸分子的構象疊加。（C）化合物3有效地填充了由Met49、Met165和His41形成的親脂性口袋，但不能與Gln189形成有效的氫鍵。（D）化合物4可以與Gln189和Glu166形成氫鍵。（E）臨床候選PF-07321332（化合物6）與SARS-CoV-2-3CL蛋白酶結合的共晶結構。（F）Cys145與化合物6的氰基形成可逆共價結合。[7]
在化合物4的基礎上，研究者進一步對結構進行優化，通過將甲基磺醯胺片段替換為三氟乙醯胺，得到了化合物5。化合物5和4對3CL蛋白酶抑制活性接近，但5在細胞模型中的抗病毒活性和滲透性都得到了顯著的提升，同時化合物5在老鼠和猴模型的測試中，展現出了較好的藥代動力學性質。
最後，對5的結構進行簡化，保留其關鍵作用片段，將5的苯並噻唑基團替換為氰基，得到了化合物6，也就是此次改造所得到的臨床分子PF-07321332（見圖4最末行數據）。
化合物6相較於2-4，具有更好的抗病毒活性和更高的生物利用度。在化合物6與SARS-CoV-2-3CL蛋白酶的孵育實驗中，研究人員發現，化合物6是可逆共價抑制劑，這意味著它比起一般的小分子共價抑制劑，脫靶帶來的毒性風險更低了。綜合考慮，化合物6具有結構相對簡單、便於工業生產放大合成、溶解性更好、製劑難度更低等優點。囙此。輝瑞最後選擇了化合物6作為臨床候選藥物進行後續的開發。
除了可以抑制SARS-CoV-2-3CL蛋白酶的活性外，研究人員還發現化合物PF-07321332具有廣泛抑制冠狀病毒3CL蛋白酶活性效果，包括β冠狀病毒（SARS-CoV-2、SARS-CoV-1、HKU1、OC43、MERS）以及α-冠狀病毒（229E，NL63）；它還表現出了對HIV-1蛋白酶（一種病毒性天冬氨醯蛋白酶）的抑制活性。
在經過層層改造之後，科學家終於得到了具有更好抗病毒活性和更高生物利用度的化合物PF-07321332。綜合考慮，PF-07321332具有結構相對簡單、便於工業生產放大合成、溶解性更好、製劑難度更低等優點，是一個非常有前景的臨床候選化合物。
藥理學評估與基於藥代性質的改造
在得到化合物6，也就是PF-07321332後，科研人員用兩種與病理相關的細胞模型評估了PF-07321332的體外抗病毒活性：表達ACE2的人腺癌來源的肺泡基底上皮細胞（A549）和分化正常的人支氣管上皮細胞（dNHBE）。兩種細胞模型的結果都表明，PF-07321332對病毒複製有强烈抑制效果。
細胞水准評估之後，輝瑞進行了體內藥效評估。
實驗人員使用小鼠適應SARS-CoV-2的動物模型，評估PF-07321332的體內抗病毒活性，結果證明，在之前體外實驗觀察到的抗病毒濃度下，它在體內也可以有效降低感染鼠肺部病毒濃度，同時能够明顯改善感染小鼠的多灶性肺部病變，這為化合物進一步向臨床應用開發提供了有效依據。
另外，研究人員繼續探究了化合物的臨床前安全性和藥物代謝特徵。
實驗結果表明，化合物PF-07321332具有較高的安全性和選擇性，在體外的遺傳毒性研究中，未顯示出致突變或致裂變的毒性。在猴口服給藥的模型中，化合物的生物利用度相對較低，這是因為，肝臟內的細胞色素P450 3A4酶（簡稱CYP3A4）會氧化外源有機小分子，以便將其排出體外。這樣一來，就降低了口服藥物的利用度（很大部分被排出了）。另外，科研人員還觀察到，PF-07321332的多個位點會被肝微粒體中的CYP3A4氧化代謝。這些研究表明，CYP3A4對PF-07321332代謝的影響至關重要。
囙此，研究人員使用CYP3A4的抑制劑Ritonavir（RTV）作為共同給藥，來改善PF-07321332的治療效果。這個策略也是借鑒了以往的抗病毒藥物給藥策略，因為RTV是幾個上市的蛋白酶抑制劑（如darunavir和lopinavir）的藥物代謝動力學增強劑[9]，它能使CYP3A4失活，减小主要抗病毒藥物的代謝清除率，改善藥物的生物利用度與藥代動力學。
圖6 PF-07321332的臨床前毒理學和健康受試者單次遞增劑量暴露研究。（A）每天給藥一次PF-07321332的大鼠口服毒代動力學暴露（第14天）。（B）每天給藥兩次PF-07321332的猴子口服毒代動力學暴露（第15天）。（C）成人口服150mg PF-07321332和250mg PF-07321332+RTV的血漿濃度變化。（D）成人口服250mg PF-07321332和100mg RTV在12小時內的血漿濃度。[7]
研究人員繼續在健康受試者中，對PF-07321332單獨給藥和與RTV聯合用藥的安全性、耐受性和藥代動力學進行了隨機、雙盲、安慰劑控制研究試驗。在每一個測試劑量中，隨機安排4比特受試者接受積極治療，2比特接受安慰劑治療。結果表明PF-07321332具有較高的安全性及耐受性，當與RTV共同給藥時，口服血漿濃度得到了顯著增加且遠高於SARS-CoV-2抗病毒的EC90值（圖6C，6D）。
種種結果表明，PF-07321332是一種可被口服吸收的SARS-CoV-2關鍵蛋白酶的抑制劑，具有非常好的體外抗病毒活性和優异的靶外選擇性，以及較高的安全性，與RTV共同給藥時，展示出了極佳的抗病毒效果和臨床應用前景。囙此，輝瑞推出了由Ritonavir和化合物PF-07321332組合而成的複方抗病毒藥物Paxlovid，進行後續臨床II/III期研究。
11月5日，輝瑞公佈了其新冠口服藥物Paxlovid（化合物PF-07321332）的三期臨床結果，資料表明，輕中度新冠患者在確診三天內服用該藥，住院或死亡風險可降低約89%。基於積極的臨床結果，獨立數據監查委員會建議提前結束臨床試驗，並向監管部門提交Paxlovid的上市申請。在結果公佈的當天，輝瑞總裁Albert Bourla在一份聲明中表示：“Paxlovid的出現將是我們抗擊疫情中一個能够‘扭轉局勢’的事件（a game-changer）。”負責該藥後期研發的一比特輝瑞首長Annaliesa Anderson告訴《紐約時報》記者，“該結果比我們能够夢想到的最好的結果都好，希望該藥幫助我們回歸正常生活與終結疫情”。美國總統拜登也表示，該藥有望成為我們手中用於對抗新冠的一個有效工具[10]。
輝瑞於11月16日正式向美國FDA提交了緊急情况下的上市申請[11]。
結語
Paxlovid的研發起始於輝瑞在SARS期間的工作，綜合考慮結構、藥代動力學性質、給藥策略等多方面，經由研究人員巧妙的改造和完備的實驗設計，最終得到了優良的臨床效果。這是藥物化學家、藥理學家、與病毒學家多學科與研究組密切合作，遵循過往的經驗與積累的知識，依靠電腦輔助，對先導分子進行成藥性設計與改造，最後取得成功的一個經典案例。
新冠疫情暴發以來，科學家們馬不停蹄，從前期的疫苗到現在的小分子藥物，試圖使用各種手段來遏制疫情的持續發展。輝瑞Paxlovid的出現，如同mRNA科技為代表的有效疫苗出現一樣，很可能是人們抗疫過程中的一個標誌性與分水嶺事件。根據現有的數據，Paxlovid的出現，可以說是對付新冠病毒感染之特效藥，堪比青黴素對抗細菌感染，有很大的希望讓人們告別懼怕新冠感染的時代。囙此，儘管疫情尚未結束，但我們依靠科學的力量在抗疫的道路上正取得一個又一個勝利與突破。通過控制傳染源（如一定程度的隔離），阻斷傳播途徑（口罩），保護易感人群（疫苗接種與有效的藥物），我們應該能够控制疫情，回歸正常的生活。
參考文獻
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[8]https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.12.293498v2
[9] Cvetkovic RS，Goa KL.Lopinavir/ritonavir: a review of its use in the management of HIV infection.Drugs.2003；63（8）：769-802.doi:10.2165/00003495-200363080-00004
[10]https://www.nytimes.com/2021/11/05/health/pfizer-covid-pill.html
[11]https://www.pfizer.com/news/press-release/press-release-detail/pfizer-seeks-emergency-use-authorization-novel-covid-19
