9月21日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所、深圳合成生物學創新研究院甘海雲課題組在美國科學院院刊（PNAS）發表了題為“複製脅迫狀態下芽殖酵母中Rad53耦聯先導鏈和後隨鏈DNA合成的機制”（A mechanism for Rad53 to couple leading- and lagging-strand DNA synthesis under replication stress in budding yeast）的文章，甘海雲研究員和哥倫比亞大學張志國教授為共同通訊作者。該項研究揭示了DNA複製檢驗點通路成員協同響應DNA複製脅迫的分子機制。作者通過分析DNA複製檢驗點通路成員對脅迫狀態下複製叉狀態的影響，發現檢驗點通路成員Mec1，Mrc1（哺乳動物中的同源蛋白為Claspin）突變後與Rad53突變體的錶型高度一致，表明DNA複製檢驗點通路是通過Rad53對複製體蛋白進行調控。
論文首頁截圖
細胞分裂前的物質準備過程中，需要完成對遺傳物質的複製。以有絲分裂為例，遺傳物質DNA的複製主要發生在分裂前的S期。DNA能否及時準確的複製，既關係到細胞能否完成分裂，也關係到遺傳資訊能否被準確的傳遞給子代細胞。然而，DNA複製過程中往往會遇到影響複製的因素，如DNA損傷，雙脫氧核糖核苷酸（dNTP）水准降低，轉錄與複製機器遭遇等。此類現象被統稱為DNA複製脅迫（replication stress）。
為了應對複製脅迫，生物體進化出了檢驗點（checkpoint）機制（圖1）：DNA複製脅迫發生時會產生單鏈DNA，感應器蛋白感受到單鏈DNA的存在後，會啟動激酶Mec1（哺乳動物中的同源蛋白為ATR），Mec1被啟動後通過磷酸化下游蛋白的形式將訊號逐級轉導至效應激酶Rad53（哺乳動物中的同源蛋白為Chk1），啟動後的Rad53會對DNA複製過程進行多重調控以應對複製脅迫。儘管Rad53作為響應DNA複製脅迫的檢驗點早已明確，但這一過程中Rad53如何協調複製機器中諸多蛋白的具體分子機制尚不清楚。
圖1 DNA損傷檢驗點通路與DNA複製檢驗點通路示意（2016，FEMSYeast Research）
2014年以來，當時作為哥倫比亞大學張志國教授團隊成員的甘海雲研究員（現為中國科學院深圳先進院合成生物學研究所研究員）就開始研究DNA複製機器響應DNA複製脅迫的機制。並與合作者共同開發了eSPAN科技（發表於2014年的Molecular Cell雜誌），該科技使得特异檢測DNA複製過程中前導鏈和後隨鏈結合蛋白成為了可能。eSPAN（enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA）科技巧妙的將BrdU（脫氧核糖核苷類似物，溴脫氧核苷尿嘧啶）標記的新生DNA鏈富集科技與染色質免疫共沉澱（ChIP）科技結合，並利用了新生前導鏈與新生後隨鏈方向不同的特徵來分析蛋白在前導鏈和後隨鏈上的結合情况（圖2）。
圖2釀酒酵母中的eSPAN科技實驗流程
研究人員利用該科技對比分析了DNA正常複製與DNA複製脅迫狀態下前導鏈與後隨鏈結合蛋白的异同。結合對比分析的結果和相關遺傳學研究結果，研究人員發現當降低胞內dNTP水准使DNA複製處於脅迫狀態時，位於滯後鏈的上的PCNA會在檢驗點激酶Mec1和Rad53的調控下，從滯後鏈上脫離以維持複製脅迫狀態下的基因組穩定。隨後研究人員進一步利用該科技對比分析了檢驗點激酶Rad53缺失與否狀態下的複製叉及其結合蛋白的狀態。當檢驗點功能缺失且複製脅迫存在時，DNA複製解旋酶CMG複合體仍會前進並解開雙鏈DNA，但前導鏈複製較滯後鏈慢，從而導致前導鏈暴露出大段單鏈區域（後續表述統稱為不對稱複製）（圖3）。這表明檢驗點激酶Rad53能够協調DNA解旋酶複合體與前導鏈和後隨鏈複製速度，從而防止大段單鏈DNA暴露引起的複製叉坍縮及DNA損傷（相關研究發表於2017年的Molecular Cell雜誌）。
圖3檢驗點通路通過RAD53來防止複製脅迫時前導鏈暴露出大段單鏈DNA區域
上述兩項研究初步揭示了檢驗點激酶Rad53在受到複製脅迫時對複製體蛋白的調控機制。然而，由於Rad53在複製檢驗點通路中處於下游位置，整個複製檢驗點通路是否參與該調控過程尚不清楚。
本項研究中，甘海雲研究員團隊通過分析DNA複製檢驗點通路成員對脅迫狀態下複製叉狀態的影響，發現檢驗點通路成員Mec1，Mrc1（哺乳動物中的同源蛋白為Claspin）突變後與Rad53突變體的錶型高度一致（不對稱複製），表明DNA複製檢驗點通路是通過Rad53對複製體蛋白進行調控。
此外，Mrc1不但具有檢驗點功能，還直接參與DNA複製。有意思的是，Mrc1檢驗點功能缺失時，細胞響應複製脅迫的錶型與Rad53突變體和Mec1突變體一致，而删除Mrc1的複製功能時，不對稱複製的錶型消失。這暗示Mrc1的複製功能可能是檢驗點Rad53的調控靶點。根據這一假設，進一步的遺傳學實驗發現在Rad53突變體中删除Mrc1會使Rad53突變體的不對稱分裂錶型消失，這一結果初步證實了上述推測。
圖4響應複製脅迫時，複製檢驗點通過Mrc1來實現對前導鏈與後隨鏈複製的調節
Mrc1是通過與Tof1-Csm3形成複合體來行使其DNA複製功能的。那麼Tof1是否也參與這一過程呢？作者進一步分析了Tof1突變體錶型，證實了Tof1也處在這一調控通路中。至此，作者解析了檢驗點蛋白是如何在複製脅迫的情况下調節DNA複製的分子機制：細胞感受到複製脅迫後，啟動了複製檢驗點通路Mec1àMrc1àRad53，啟動後的Rad53則通過調節Mrc1-Tof1來實現對前導鏈和後隨鏈的複製協調以防止出現單鏈DNA造成基因組不穩定（圖4）。
該工作中由甘海雲研究員團隊完成的研究得到了基金委國自然重大專項、廣東省合成基因組學重點實驗室、以及深圳合成生物學創新研究院的資助。
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