近日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所、深圳合成生物學創新研究院甘海雲課題組、李楠課題組和梅奧醫學中心王志全團隊合作在Genomics，Proteomics & Bioinformatics雜誌發表了題為“Defining Proximity Proteomics of Histone Modifications by Antibody-mediated Protein A-APEX2 Labeling”的文章，甘海雲研究員、李楠副研究員和王志全教授為共同通訊作者。李欣然、周嘉琦、趙文娟和文青為本文的共同第一作者。該項研究開發了一種可用於識別被修飾組蛋白周圍蛋白質的臨近標記新技術——AMAPEX（Antibody-mediated protein A- ascorbate peroxidase 2 labeling）。
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文章連結：https://doi.org/10.1016/j.gpb.2021.09.003
許多生物過程是通過蛋白質和核酸的分子相互作用來執行和調節的，包括蛋白質-蛋白質相互作用、蛋白質-RNA相互作用和蛋白質-DNA相互作用。這些相互作用關係的失衡會導致人類各種疾病的發生，如癌症、免疫失調和神經退行性疾病等。囙此，研究細胞中這些分子間的相互作用的方法對瞭解人類疾病的生物學過程及其治療提供有利的工具。
傳統的親和純化和酵母雙雜交方法已被廣泛應用於發現潜在的分子相互作用。基於抗體的親和純化與基於質譜的蛋白質組學結合，可以富集和鑒定與特定蛋白質分子發生穩定相互作用的其他蛋白分子。這些科技的發展擴大了我們對各種系統中蛋白質相互作用網絡的理解。親和純化也可以結合交聯和核酸測序來鑒定蛋白與核酸間的相互作用，如染色質免疫沉澱測序（ChIP-seq）和RNA免疫沉澱測序（RIP-seq）。然而，親和純化的主要局限性是，在細胞裂解和隨後的洗滌步驟中，往往會失去微弱或短暫的相互作用。為了克服這一點，親和純化可以與交聯相結合，但交聯後假陽性較高。此外，親和純化在應用於不溶性靶點或缺乏高親和抗體的蛋白誘餌方面具有挑戰性。酵母雙雜交和其他蛋白質互補實驗代表了另一種繪製活細胞中蛋白質間、蛋白質與RNA、蛋白質與DNA相互作用的方法。這些方法通常是高通量的，能够篩選成千上萬個潜在的分子間相互作用。然而，許多蛋白質互補分析具有局限性，比如酵母雙雜交不能研究膜蛋白。
臨近標記科技（Proximity labeling，PL）的發展為傳統的在活細胞中研究分子間相互作用的方法提供了補充，該科技一般利用CRISPR基因編輯科技或基於質粒的表達將臨近生物素化酶與誘餌蛋白在細胞內融合表達。在添加外源生物素後，誘餌蛋白臨近的蛋白質會被生物素化，這些生物素化的蛋白質可以被鏈黴親和素偶聯的磁珠富集，之後可以通過質譜進行分析鑒定。現時最常用的臨近生物素化酶包括抗壞血酸過氧化物酶APEX/APEX2、辣根過氧化物酶HRP和生物素連接酶BioID、BASU、TurboID、miniTurbo等。
工程化抗壞血酸過氧化物酶（APEX2）是由源自植物的抗壞血酸過氧化物酶經工程化改造而來。APEX2是一種非常快速的臨近標記過氧化物酶，它可以與生物素苯酚在H2O2的催化下生成生物素-苯氧自由基，這些自由基與富含電子的特定胺基酸（如Tyr、Trp、Cys和His）反應，使生物素被共價連接到蛋白質上。由於苯氧基的半衰期很短（<1 ms），又不能透過生物膜，使其活性範圍限制在20 nm以內，囙此只有距離目標蛋白20 nm以內的蛋白質會被標記。另外，APEX2標記的另一大優勢便是反應速度很快，1 min內即可完成所需的標記。
如上所述，儘管APEX2作為臨近標記酶有很大優勢，但是現時現有的研究方法依賴於基因編輯科技，需要將工程化酶在細胞內表達外源融合蛋白，這限制了其在難以轉染的細胞系、原代細胞、組織和病理樣品中的應用，且不能應用於翻譯後修飾的蛋白（例如組蛋白修飾）。為了解决這些限制條件，甘海雲課題組研究開發了一種由抗體介導的pA-APEX2臨近標記新技術（AMAPEX）。該科技將Protein A與經過改造的抗壞血酸過氧化物酶APEX2結合形成pA-APEX2，通過特异性的抗體，將pA-APEX2靶向到被修飾的目標組蛋白。當細胞中存在底物生物素酚和過氧化氫時，APEX2可以把生物素標記到距目標蛋白半徑約20nm範圍內的所有臨近蛋白上。之後由於生物素與抗生物素蛋白鏈黴親和素（Streptavidin）之間的極强的親和力，可以利用鏈黴親和素磁珠將生物素標記的蛋白質純化出來，最後通過LC-MS/MS分析便可鑒定出目標蛋白周圍的蛋白質，進而研究哺乳動物細胞中蛋白質-蛋白質的相互作用關係。如圖1所示。
圖1抗體介導的pA-APEX2臨近標記方法構建流程
通過質譜分析，該方法可精准鑒定出了小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）中組蛋白H3K27me3相關PRC1和PRC2亞基複合物，並與已有兩種方法的比較（BAC-GFP[1]和ChromID[2]），其鑒定範圍和準確度有較大提升。此外通過CO-IP驗證了NSD2與H3K27me3存在相互作用，證明了該方法的實用性（圖2）。
總體而言，AMAPEX是一種非常有效的工具，我們可以通過它識別與修飾組蛋白相鄰的蛋白質，研究蛋白質間的相互作用，拓展對蛋白間互作網絡的認識，進而有助於我們探明由調控網絡紊亂造成的各種疾病的發生機理，從而為疾病治療奠定基礎。
圖2利用AMAPEX方法鑒定組蛋白H3K27me3臨近蛋白質組
該工作中由甘海雲研究員團隊完成的研究得到了基金委國家重點研發計畫、國家自然科學基金重大專項、國家自然科學基金面上項目、廣東省合成基因組學重點實驗室、以及深圳合成生物學創新研究院的資助。
參考文獻
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