正值春運返鄉大潮，核酸檢測成了熱詞，沒有被捅過鼻子或喉嚨的人生是不完整的。在過去的一年裏，陰性核酸檢測報告在普通人的工作、生活裏頻頻亮相，在很多時候成為返鄉、出差、看病、出行等必不可少的通行證。在疫情防控的背景下，核酸檢測是我們確定是否感染新冠病毒最有效的手段。我們所說的核酸檢測是基於RT-PCR科技檢測SARSCOV-2（新冠病毒）的方法，準確率非常高，但需要複雜的儀器和熟練的科技人員，且耗時較長。疫情突發時，醫護人員經常徹夜不眠採集樣本，就是為了以最快的時間準確、高效地鎖定病毒感染者。
現場即時檢測（point-of-care testing，POCT）是在採樣現場進行的、利用可擕式設備及配套試劑快速得到檢測結果的新方法，具有便攜、成本低、上樣量少等優點，對於傳染病和人類疾病的快速診斷尤為重要。驗孕試紙（pregnancy test strip，PTS）是一種側向層析試紙條，通過檢測尿液中hCG（人絨毛膜促性腺激素）的濃度，來判斷婦女是否懷孕。
驗孕試紙工作原理示意圖
可以通過重新設計驗孕試紙（PTS）以達到檢測其他物質的目的，比如DNA和RNA，其覈心在與將目標物的存在轉化為hCG的產生，現時已經取得了許多進展，但也存在著諸如訊號穩定性和操作靈活性差、檢測靈敏度低、檢測目標局限性大等問題。中科院長春應化所李冰淩研究員、杜衍研究員及其團隊提出了一種基於CLIPON的方法，集成了核酸-hCG聯合探針（NHP）、CRISPR-Cas12a、CRISPR RNA（crRNA）和大尺寸DNA組裝體（CLD）等四大要素，為上述問題提供了全面的解決方案，並應用於檢測人乳頭瘤病毒（HPV）DNA、SARS-CoV-2冠狀病毒基因組RNA和腺苷（非核酸目標物）等。研究內容以CLIPON: A CRISPR-Enabled Strategy that Turns Commercial Pregnancy Test Strips into General Point-of-Need Test Devices為題發表在《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》
【技術路線和檢測原理】
圖1.CLIPON：以雙鏈DNA作為檢測目標物的檢測原理圖示
crRNA與部分DNA靶標互補使得crRNA/CRISPR-Cas12a複合物能够特异性識別感興趣的靶標；crRNA/CRISPR-Cas12a複合物與DNA靶標的結合會啟動Cas12a的非特异性DNA切割活性。啟動的Cas12a隨後切割NHP的DNA tag；最後，經過設計的大尺寸DNA組裝體能够與NHP內的DNA tag結合，從而封锁NHP在PTS上遷移；通過靶向誘導切割去除DNA tag後，NHP的hCG成分就不能與CLD結合，囙此NHP可以在層析試紙上遷移，從而產生訊號；因而，當含有DNA目標物時，PTS上同時出現一條檢測線和一條對照線，而當不含DNA目標物時，則只出現一條對照線，這就實現了對目標訊號的檢測。基於CLIPON的策略有兩大優勢：首先，使用CRISPR-Cas12a介導的DNA識別來啟動CRISPR的反式DNA切割活性，提供了更高的識別特异性和酶促轉換來放大識別事件。其次，以往的方法只能直接檢測ss核酸靶點，而CLIPON可以檢測ss（單鏈）和ds（雙鏈）兩種形式的核酸，囙此可用於大部分生物DNA的檢測。第三，NHP中的DNA tag完全獨立於待檢測目標，單個NHP可用於檢測任何感興趣的目標。第四，CLD直接由環介導的等溫擴增（LAMP）製備，這是一種簡單、經濟、廣泛使用的核酸擴增科技。
【CLIPON的檢測效果】
圖2.使用雙鏈DNA tag目標物驗證CLIPON
文中通過瓊脂糖凝膠電泳證實了CLD對NHP的捕獲能力。將CLD與NHP混合確實封锁了NHP在PTS上的遷移（圖2b），與單獨使用NHP時的强測試線相比，CLD和NHP混合後測試線消失。此外，NHP和CLD都可以冷凍乾燥長期儲存，凍幹後的資料與新製備的資料表現出類似的效能。檢測不含目標物的樣本時不出現測試線，目標物dsDNA-T1濃度為50 pM出現可見測試線，這說明在不進行訊號放大的情况下，CLIPON可以實現50 pM的檢測限（LOD）。而隨著dsDNA-T1的濃度逐漸新增，測試線的顏色也增强。研究人員還開發了一款名為“CLIPON image indicator”的手機app，用於量化PTS的顏色强度。還設計了一款掌上型微流控晶片，以進一步簡化現場測試。結合高效的重組酶聚合酶擴增（RPA）反應可以進一步提高檢出限，RPA-CLIPON的工作機制如圖3a所示。
圖3.RPA-CLIPON：將CLIPON與重組酶聚合酶擴增（RPA）偶聯，以高靈敏度檢測DNA基因組
研究人員接著對HPV患者的分泌物進行檢測，結果表明，RPA-CLIPON能够從臨床樣本中檢測HPV-16。針對SARS-CoV-2 RNA基因組的檢測表明，所設計的RPA-CLIPON-SARS-CoV-2體系能够在低水準（20 copies/μL）下特异性地檢測dsDNA-SARS-CoV-2。由於很難獲得真實的SARS-CoV-2樣本，實驗選擇了具有相同病毒結構但無傳染性的假病毒，結果表明RPA-CLIPON能够檢測1000copy/mL（相當於1.6aM）的RNA-SARS-CoV-2，靈敏度能够滿足2019冠狀病毒的臨床檢測需求。RPA-CLIPON也可用於檢測非核酸目標物（50μM的腺苷），隨著腺苷濃度的新增，測試線越來越强。
圖4.RPA-CLIPON檢測RNA-SARS-CoV-2（與新冠相同的病毒結構但無傳染性）
【結論】
文中合理設計綜合了含驗孕試紙（PTS）、CRISPR-Cas12a、大尺寸DNA組裝物的CLIPON生物傳感平臺，提供了快速檢測的新途徑，可對DNA、RNA和非核酸目標進行檢測。還搭配了手機App和可擕式微流控晶片，使得CLIPON測試平臺高度自動化，方便快捷。能够檢測HPV DNA和SARS-CoV-2 RNA，檢出限低至~aM LOD，單次檢測成本3-7美元。現時還需要對上游樣品和處理過程進行進一步的優化，以實現真正的可擕式，滿足現場即時檢測（POCT）的需求。
文章來源：
https://doi.org/10.1002/anie.202115907