作者:壺江漁夫
宮頸黏膜是抵禦病原體侵入女性上部生殖道的保護屏障,經常受到入侵病原體和生態失調的挑戰。宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤,是僅次於乳腺癌的威脅女性健康的第二大「癌症殺手」。我國每年新發宮頸癌患者約13.2萬人,約占世界宮頸癌新發病例總數的一半,而死於宮頸癌的患者多達5.3萬人。宮頸癌嚴重威脅著我國女性的健康。
眾所周知,HPV是促進宮頸癌發生發展的重要病原體。但是研究表明,80%以上的女性在其一生中都會感染HPV,但只有不到2%的女性會患上宮頸癌。除HPV外,沙眼衣原體(C. trachomatis)也是宮頸感染的常見病原體。在浸潤性宮頸癌和卵巢癌患者中,沙眼衣原體合併HPV感染的發生率新增。有研究者認為衣原體感染可能改變患者的免疫力,使其對HPV易感,從而易進展為宮頸癌,但合併感染的動力學和潜在機制尚不清楚。
繼Hans Clevers團隊開發了首個宮頸癌類器官(Organoids)模型後【1】,類器官在宮頸癌中的研究得到了進一步的重視和推動。類器官可以在體外很好地類比體內器官的三維結構和功能,相比於二維的細胞系和單純的小鼠模型具有其獨特的優勢,已被廣泛應用於功能組織誘導、疾病模型構建、藥物篩選等研究中。
2022年2月24日,來自德國的Cindrilla Chumduri團隊開發了一種類比HPV和沙眼衣原體共感染的宮頸癌類器官模型,並闡明了HPV和沙眼衣原體(C. trachomatis)共感染誘導的獨特轉錄和翻譯後導致宿主細胞重程式設計的機制,揭示了宮頸癌的發生發展機制。
該成果以Modelling Chlamydia and HPV co-infection in patient-derived ectocervix organoids reveals distinct cellular reprogramming為題,近期發表在Nature Communications期刊上【2】。
宮頸癌類器官模型的構建
HPV E6E7是指人乳頭瘤病毒的E6和E7兩個基因,兩者都是早期轉錄基因,常用來檢測是否有HPV感染,以及感染的嚴重程度。HPV E6E7基因陽性,代表感染了HPV病毒,病毒DNA已經綜合到了細胞DNA中,同時進行了蛋白質的表達。
為了系統評估hpv16 E6E7綜合和隨後與沙眼梭菌合併感染對宿主調節的影響,研究人員從健康志願者上分離出宮頸外幹細胞,將其嵌入基質膠中培養3D類器官,並檢測了來自各種HPV類型的E6E7基因。來自三個供體的子宮頸外器官檢測HPV的E6E7癌基因均為陰性。這些來自健康供體的HPV E6E7陰性的類器官被用於研究HPV綜合對健康宮頸組織的影響。
隨後,研究人員用攜帶HPV16 E6E7癌基因的慢病毒轉染hCEcto(human ectocervical,人子宮頸)上皮幹細胞,將E6E7綜合到宿主細胞基因組中。結果發現,HPV16 E6E7綜合到外宮頸類器官中會誘導一種具有子宮頸上皮不典型增生(CIN,被認為是癌前病變)特徵的錶型。
囙此,這種宮頸類器官模型的構建為研究HPV和共感染生物學開闢了一條途徑。
沙眼衣原體與HPV合併感染引起獨特的轉錄反應
為了探究宮頸中沙眼衣原體和HPV共感染的影響及其相互作用,研究人員又在上述HPV類器官模型的基礎上,構建了沙眼衣原體共感染的類器官模型。結果發現,HPV E6E7的表達干擾了沙眼衣原體的正常發育,而且還發現,沙眼衣原體感染在單一感染和與HPV E6E7的聯合感染中均誘導增殖訊號。
接下來,研究人員進行了轉錄組分析以確定沙眼衣原體、HPV E6E7單一感染和合併感染對細胞信號傳導的影響。結果發現,hCEcto E6E7細胞與沙眼衣原體的共感染表現出獨特的基因表達變化。引人注目的是,在被HPV E6E7上調的基因中,28%的基因在與沙眼衣原體共感染時恢復到與對照相似的表達水准,或者被强烈下調。
其中,E2F家族成員是最顯著的反向調節轉錄因數。E2F靶基因被HPV E6E7顯著上調,但在沙眼衣原體感染後下調。現時尚不清楚這種沙眼衣原體介導的對HPV E6E7誘導的E2F靶標的抑制將對宿主細胞和病原體產生什麼影響。
為了研究兩種病原體對Rb-E2F1途徑的調節,研究人員用沙眼衣原體感染了hCEcto類器官和hCEcto E6E7類器官,並進行了qRT-PCR和免疫印迹分析。結果顯示,在沒有HPV E6E7表達的情况下,沙眼衣原體顯著抑制E2F1和腫瘤抑制因數p53,而共感染導致TP53明顯減少,但E2F1和RB1轉錄本沒有顯著减少。
與沙眼衣原體感染相反,HPV E6E7上調TP53、E2F1和RB1基因表達。無論是否感染HPV,沙眼衣原體感染hCEcto細胞後,總Rb、pRb(S807/811)、E2F1和p53蛋白减少。然而,E6E7表達新增E2F1蛋白水准並誘導p53幾乎完全降解,而對總Rb、pRb(S807/811)蛋白水准沒有顯著影響。
囙此,上述結果表明,HPV會誘導E2F1啟動,而衣原體則對其發揮抑制作用。感染HPV後,p53在轉錄水准上上調,而在感染衣原體後下調。HPV和衣原體共同感染導致p53蛋白降解。
隨後,研究人員通過在未感染、感染沙眼衣原體、表達E6E7和共感染的hCEcto細胞之間進行GSEA分析,評估受差异表達基因(DEG)影響的生物學功能。結果發現,HPV E6E7和沙眼衣原體均强烈上調腫瘤壞死因數(TNF)通路,促進宿主細胞幹性並减少分化。
值得一提的是,參與DNA複製的通路、DNA損傷修復通路包括堿基切除修復(BER)、錯配修復(MMR)、核苷酸切除修復(NER)、範可尼貧血(FA)、同源重組(HR)和p53訊號通路是由兩種病原體相反調節:HPV E6E7表達啟動這些途徑,而沙眼衣原體抑制它們。
沙眼衣原體感染抑制DNA錯配修復通路
由於E2F轉錄因數家族(參與細胞增殖和生長停滯的幾個基因的重要調節因數)被沙眼衣原體和共感染下調,研究人員進一步分析了E2F轉錄因數家族在衣原體感染細胞中發揮的作用。
RB樣、E2F4、多種外陰B類蛋白和二聚化伴侶(DP1)通過形成DREAM複合物,可介導基因抑制促進靜止。若失去細胞週期檢查點基因表達,DREAM複合物介導的調控將會中斷,進而打破細胞週期的平衡,從靜止切換到增殖,這在癌症中經常觀察到。
該研究分析顯示,許多DREAM複合靶基因被衣原體下調,在合併感染中可以封锁靜止並促進細胞增殖。而且參與DNA修復途徑的基因屬於受衣原體和HPV反向調控的E2F1靶基因。沙眼衣原體感染導致HPV誘導的MMR(mismatch repair,錯配修復)基因的抑制。
總之,衣原體在轉錄和翻譯後水准抑制MMR,並且它可以進一步抑制HPV啟動的MMR。
衣原體和HPV調節MMR途徑的機制
最後,研究人員試圖從機制上闡明衣原體和HPV是如何調節MMR途徑的。
根據文獻報導,MMR基因受E2F轉錄因數的調節。Rb-E2F和MDM2-p53通路之間存在廣泛的串擾,而且兩者在大多數人類腫瘤中都存在缺陷,這強調了這些通路在調節重要細胞決策中的關鍵作用。
研究人員採用了蛋白酶抑制劑MG-132和Lactacystin來抑制細胞和衣原體蛋白酶CPAF32,使用Nutlin-3a抑制MDM2和p53之間相互作用,以檢測p53穩定對MMR基因表達和蛋白水准的影響。結果表明,Nutlin-3a和MG-132處理恢復了沙眼衣原體感染後的MMR基因表達,並可以抑制沙眼衣原體誘導的p53降解,而E2F1的降解在所有處理條件下均降低。
值得注意的是,MMR蛋白MLH1和MSH6僅通過MG-132抑制蛋白酶體活性得以恢復。該結果表明,衣原體參與不依賴p53的蛋白酶體降解以减少E2F1和MMR蛋白,而E2F1和p53蛋白的恢復可以挽救MMR基因的轉錄抑制。
為了進一步研究沙眼衣原體如何調節HPV E6E7共感染中的MMR途徑,在有或沒有沙眼衣原體感染的情况下,用Nutlin-3a、MG-132和Lactacystin處理hCEcto E6E7幹細胞。結果顯示,所有處理條件都降低了沙眼衣原體的感染性。以上結果表明,蛋白酶體降解是一種重要機制,可明顯調節E2F介導的MMR基因轉錄並减少共感染中的p53、E2F和MMR蛋白。
研究意義
超過80%的女性在其一生中會感染HPV,但只有不到2%的女性會患上宮頸癌。而宮頸癌患者常常同時感染人乳頭瘤病毒(HPV)和沙眼衣原體,囙此科學家推測沙眼衣原體和HPV合併感染是驅動惡性組織形成的重要因素,但其背後潜在的機制仍然是未知的。
病毒可以在腫瘤中留下可檢測的DNA片段,在90%以上的宮頸癌中可以檢測到病毒的DNA片段。但與病毒不同,衣原體很少在癌細胞中留下可檢測的元素,囙此其誘發癌變的具體機理難以分清。
在該研究中,研究人員開發了一種類比HPV和沙眼衣原體共感染的宮頸癌類器官模型,並闡明了HPV和沙眼衣原體合併感染後,會導致宿主獨特的細胞重程式設計。該研究將衣原體感染與宮頸癌的發展聯系起來,進一步揭示了宮頸癌的發生發展機制。
被HPV和衣原體感染後,多個基因以不同的管道上調或下調,影響宿主的免疫應答和DNA損傷修復。總體而言,兩種病原體在幹細胞中的合併感染可能會對細胞和基因組穩定性產生不利影響,並促進腫瘤進展。
這項研究還具有兩個關鍵意義:
1)研究人員引入了一種宮頸類器官模型,以研究分層上皮組織屏障與HPV16 E6E7和衣原體的個體和共感染動力學的相互作用。該研究中開發和使用的宮頸類器官被證明是出色的體外模型,可用於研究上皮組織與病原體之間的複雜相互作用以及分析發病初期事件的分子後遺症。
2)研究人員系統地揭示了HPV16 E6E7和沙眼衣原體對宿主細胞的影響,展示了多重或連續感染帶來的危害以及導致致癌的分子機制,闡明了宮頸癌的發生發展機制。
參考文獻:
https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(21)00118-1
https://www.nature.com/articles/s41467-022-28569-1