近日，Nature Biomedical Engineering（《自然·生物醫學工程》）線上發表武漢大學醫學研究院、中南醫院醫學研究院、教育部免疫與代謝前沿科學中心殷昊教授與張楹教授課題組在新冠病毒核酸檢測領域的最新成果：課題組開發出了一種高靈敏度、高特异性、操作便捷且快速的核酸檢測方法。
論文題為“Fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 RNA using suboptimal protospacer adjacent motifs for Cas12a”（《Cas12a非經典PAM介導的新冠病毒快檢方法》），第一作者為武漢大學醫學研究院研究生蘆舒涵、佟曉晗，殷昊、張楹為通訊作者，武漢大學為第一署名組織。
新冠病毒（SARS-CoV-2）在全球範圍內大肆傳播，新冠變異株的流行使疫情防控更具挑戰。快速篩查是控制疫情傳播最有效的手段。RT-qPCR是現時新冠病毒的檢測金標準。該方法特异性强、靈敏度高，但是由於其依賴實驗室專業儀器和專業人員操作，存在耗時長等問題（從採樣到出結果大致需要6小時），難以應對病毒驚人的傳播速度。囙此，亟須研發一種新的快速核酸檢測方法。
課題組首次靶向非經典PAM建立了兼具快速（15-20分鐘）、靈敏（和qPCR相當）、穩定和特异的核酸檢測一步法（sPAMC），並在SARS-CoV-2真實樣本中達到94.2%準確度並無一例假陽性。sPAMC科技僅需20分鐘就能檢測到Ct值為35.8的新冠真實樣品，並且用可擕式紫外燈或藍光燈照射即可觀察到結果。
CRISPR/Cas系統不僅用於基因編輯，也被研發為核酸檢測工具。Cas12和Cas13特异性切割雙鏈DNA底物（順式切割）後，會啟動其非特异性切割單鏈DNA或RNA的能力（反式切割）1-5。CRISPR特异性由兩部分共同决定，一部分是crRNA和靶DNA之間的堿基配對，另一部分是Cas蛋白複合體和位於靶DNA旁的短序列形成非共價結合，後者被稱為PAM（Protospacer Adjacent Motif）。當Cas12搜尋到底物上的PAM序列，在crRNA和靶DNA堿基配對之後，進而特异性切割dsDNA，隨後啟動其反式切割能力，快速降解單鏈DNA報告系統，釋放出的螢光訊號。新冠病毒檢測的兩步法（SHERLOCK和DETECTR）先通過等溫擴增富集待檢的核酸片段，再加入CRISPR/Cas切割體系產生訊號。雖然兩步法兼具高特异性、高靈敏度等優點，卻新增了操作複雜度和引入交叉污染等問題6,7。STOPCovid是在兩步法基礎上優化出的一步檢測法，即在一個反應試管中同時進行樣品擴增和切割反應，雖然簡化了操作步驟並降低交叉污染風險，但靈敏度顯著低於兩步法，且需要約45分鐘至1小時左右的反應時間8,9。
課題組致力於研發能滿足快速簡便、靈敏特异的一步法核酸檢測新方法。通過比較新冠病毒序列中四個位點的非經典PAM（VTTV，TVTV，VTTV）和經典PAM（TTTV）的反式切割活力和一步法效率，發現和經典PAM相比，非經典PAM顯著加快檢測速度，將靈敏度提高了10-100倍，大幅度提升訊號的穩定性。進一步探索機制發現：在一步法反應中，等溫擴增和CRISPR檢測存在競爭關係。當Cas12a遇到經典PAM時，由於切割能力過强，等溫反應擴增出來的目的片段被快速消耗，難以達到指數擴增，導致底物無法有效富集，螢光訊號延遲產生且不穩定；而對於非經典PAM介導的一步法，Cas12a和底物的結合能力弱。在反應初期，等溫擴增佔據主導地位，快速富集足够的底物，為反應後期Cas12a切割和螢光釋放奠定前期基礎。
非經典和經典PAM介導的一步法快檢方法概覽圖
課題組將非經典PAM介導的一步法檢測科技命名為sPAMC（for suboptimal PAM of Cas12a-based test with enhanced flexibility，speed，sensitivity，and reproducibility），並將sPAMC應用到SARS-CoV-2真實樣品檢測。研究者們共檢測了204個咽拭子樣本，在104個RT-qPCR陽性樣本中，sPAMC能檢出98個，剩餘的100個陰性樣本均未檢出，證明了sPAMC有94.2%的檢出率且無假陽性。sPAMC科技僅需20分鐘就能檢測到Ct值為35.8的新冠真實樣品，並且僅用可擕式紫外燈或藍光燈照射即可觀察到結果。
非經典PAM的快檢方法sPAMC相比於傳統一步法有如下優點：1）檢測速度提高2-3倍，可以實現在10-15分鐘內檢測出DNA病毒，15-20分鐘內檢測出RNA病毒；2）螢光訊號結果在樣本間的可重複性高，螢光訊號波動少於30%；3）檢測靈敏度提高，與qPCR一致；4）極大地拓寬了靶向的檢測位點可選擇性，可選擇的非經典PAM組合為經典PAM的7倍以上。研究者首次提出了通過靶向非經典PAM，降低Cas12a的順式和反式切割速率的方法來實現核酸檢測，為開發建立更快更靈敏的CRISPR核酸檢測方法提供了新思路。
本研究獲得武漢大學醫學研究院儀器設備共亯中心、武漢大學中南醫院和中國醫學科學院武漢感染性疾病及腫瘤研究中心的支持。本項工作得到了國家自然基金和科技部重點研發計畫的資助。
原文連結：https://www.nature.com/articles/s41551-022-00861-x