作者：韓麗麗，曹苗苗等
來源：科技導報
病毒是地球上數量最多的生物實體，在調控宿主群落組成、推動宿主進化及影響土壤元素的生物地球化學迴圈等方面起著非常重要的作用。
本文分析了土壤病毒生態學常用研究方法，闡述了土壤病毒的多樣性、病毒在土壤生態系統中的生態功能；展望了環境噬菌體的應用及發展前景。
病毒是地球上數量最多的生物實體，可以感染任何細胞生物。據估計，地球上存在4.80×1031個病毒顆粒，約為原核細胞數量的10倍。
地球上不同環境中病毒顆粒豐度估算
土壤中約含有4.88×1030個病毒顆粒，它們可調控微生物的死亡率和群落結構、推動宿主進化以及影響土壤元素的生物地球化學化學迴圈，在構建健康土壤環境、調控根際微生態、促進植物生長，乃至影響全球氣候變化等方面發揮重要作用。
土壤病毒的研究方法
病毒的錶型與豐度
土壤病毒錶型及豐度的測定方法主要有噬菌斑計數、螢光顯微鏡（EFM）計數、透射電鏡錶型及計數以及流式細胞儀計數等。
EFM對研究土壤中病毒豐度、病毒與微生物的豐度比（VMR）及病毒的複製策略至關重要，但由於無法檢測單鏈DNA和RNA病毒，EFM可能會低估病毒豐度。
土壤病毒螢光顯微計數
Williamson等發現不同土壤類型中的游離病毒豐度差異較大，一般來說在熱沙漠中最低，在農田土壤和冷沙漠中居中，在森林和濕地土壤中最高。
結合meta分析發現土壤病毒的豐度受多種環境因數的影響，如pH值、溫度、土壤濕度、土壤深度等。
病毒的分子標記基因多樣性
病毒缺乏通用型引子，僅在某些病毒類群中存在一些相對保守的基因，通過這些標記基因可以研究特定病毒類群的系統發育關係和多樣性。
上錶歸納了一些常見的病毒標記基因，其中g20和g23是常用的標記基因，phoH基因也常被用於海洋噬菌體多樣性的研究，且不局限於某一特定的噬菌體家族。
但由於病毒的功能基因保守性較低，容易出現擴增序列的假陽性，囙此將標記基因用於病毒豐度的測定及大量樣品的研究還存在一定的局限性。
巨集病毒組學研究
現時，巨集病毒組學是病毒多樣性研究的主要手段，一般需要採取3個主要步驟：對環境樣品中的病毒進行濃縮、純化濃縮後的病毒粒子以減少污染、測序前擴增病毒核酸。
土壤病毒組DNA選取過程
土壤巨集病毒組學現時還處於初級發展階段，受到各方面的挑戰，例如將病毒與土壤顆粒有效分散、分離病毒粒子、有效擴增病毒DNA、有限的土壤病毒資料庫等。
土壤性質的高度可變性可能會影響土壤病毒吸附與重懸浮，不同土壤類型需要採用不同的重懸浮方法。
病毒粒子選取方法主要有切向流過濾、聚乙二醇沉澱法和氯化銫密度梯度離心法。
巨集病毒組生物資訊學分析
巨集病毒組分析是土壤病毒生態學研究的重點，主要包括3個關鍵步驟：去除污染的細胞DNA、病毒的物種和功能注釋、病毒宿主溯源。
在病毒選取及測序過程中可能會引入一些污染的細胞DNA，在分析病毒基因組前需要去除潜在的細胞基因組。
現時國外學者相繼開發出多款資料分析軟件用於巨集病毒組數據的解析。
預測病毒宿主也是瞭解病毒生態功能的重要手段之一，現時的方法主要有：基於病毒基因組與參攷病毒基因組之間的相似性，通過參攷基因組獲取病毒宿主資訊；基於病毒基因組與宿主基因組之間的相似性；根據宿主核苷酸特徵來推測，但這種方法僅能預測屬以上水准的宿主；通過比較宿主和病毒序列在空間及時間尺度上的豐度分佈來計算預測相關性，或通過更複雜模型的交互作用來預測宿主。
現時仍存在一些科技問題亟待解决：病毒的富集依然是病毒組研究的瓶頸，該過程中浸提液的選擇也至關重要；因病毒的基因組較小，實際直接選取的病毒DNA量很難達到測序要求；公共資料庫中病毒資料庫的占比仍非常小，且對病毒組分析發現土壤中近70%的病毒基因序列是未知的。
總的來說，鑒於現時有限的土壤類型以及樣品數量，土壤病毒學的發展仍然任重而道遠。
土壤病毒的生態功能
病毒調控宿主群落組成
根據病毒在宿主中的複製策略，可將病毒分為烈性病毒、溶源性病毒及慢性病毒。
烈性病毒的繁殖週期主要包括吸附、侵入、複製和生物合成、組裝、裂解這5個階段；溶源性病毒在侵染宿主時，可將自身的遺傳物質綜合到宿主的基因組中，或以質粒的形式存在於細胞內，並伴隨著宿主的繁殖進行複製，但不產生子代病毒；慢性病毒可侵染宿主，在宿主胞內複製繁殖，但遺傳物質不綜合到宿主基因組上，該過程可導致宿主的生長和代謝變得緩慢。
烈性病毒（這裡主要指烈性噬菌體）對宿主種群控制的動態變化遵循捕食-被捕食關係的經典規律。
如殺死優勝者（KtW）假說，該模型認為密度和頻率依賴的病毒捕食可抑制快速生長的優勢菌群的繁殖，維持受攻擊宿主的種群平衡從而保持微生物群落的多樣性，在海洋和土壤生態系統中均觀察到了KtW現象。
此外，Knowles等提出了PtW模型，認為在海洋中宿主密度的升高將新增溶源性過程，即“微生物越多，病毒越少”，近期發現PtW現象也存在於土壤中，但影響病毒的分佈特徵及複製策略的驅動因數現時仍不清楚。
病毒影響宿主進化
病毒在感染宿主時，向宿主細胞內引入新的基因，從而引起基因重組，這一過程稱為病毒介導的水准基因轉移——轉導。
普遍轉導發生於烈性感染時，在裂解週期中，新病毒顆粒的衣殼可能會意外包裹宿主DNA，在病毒感染下一個宿主時，將誤裝入的遺傳物質釋放到新的宿主內，在宿主基因組中發生重組。
溶源性病毒介導的轉導為局限性轉導，病毒特异性切斷宿主基因組，將某一段基因綜合到自己的基因組上，感染下一個宿主時發生基因重組。
所有的轉導過程都對宿主基因組有重要影響，尤其是局限性轉導賦予宿主新的功能，增强宿主的適應性，擴寬宿主的生態位，同時也促進了宿主的進化。
細菌-噬菌體共同進化增强了細菌和噬菌體的錶型和遺傳多樣性，是微生物群落進化過程的主要推動力，也是微生物生態學研究的覈心內容之一。
細菌在與病毒對抗的過程中，形成了多種防禦機制，如細菌通過改變噬菌體的結合受體，以及通過限制-修飾系統或者CRISPR-Cas系統抵抗病毒感染。
當宿主改變表面或內部噬菌體吸附相關的結構時，噬菌體也可以修改其目標受體或者與宿主相互作用的結構，使其能够再次與宿主進行有效的相互作用。
於是一場關於進化的“軍備競賽”應運而生，（反覆運算的）選擇性過程驅動生物相互作用的多樣性，提高進化速率，從而推動宿主進化。
病毒參與土壤元素的生物地球化學迴圈
病毒作為生物泵影響土壤元素生物地球化學迴圈
病毒是海洋碳迴圈的重要驅動者，由病毒推動的碳迴圈量占整個海洋生態系統碳迴圈總量的6%~26%。
海洋環境中微生物被病毒裂解後產生細胞碎片，其中可溶性有機物可以被微生物迅速利用，而顆粒態有機物可以沉降至含氧量很低的海底穩定保存，這一過程稱為生物碳泵。
病毒的裂解式捕食管道使海洋表層每年可向深層海域輸送3 Gt的碳。
此外，病毒裂解的微生物可被細菌再礦化，起著海洋再循環系統的作用，這一過程被稱為病毒轉軌。
土壤中同樣也存在病毒轉軌過程，即土壤微生物被病毒感染裂解死亡，導致微生物中的營養元素釋放出來被其他微生物和植物利用。
病毒攜帶輔助代謝基因間接參與土壤元素生物地球化學迴圈
隨著宏基因組學或巨集病毒組學的發展，在海洋中發現了大量病毒攜帶宿主的輔助代謝基因（AMGs），涵蓋多種參與元素迴圈的關鍵步驟基因。
這些AMGs可以在病毒侵染宿主後在宿主胞內表達，改變宿主代謝過程，從而參與元素的生物地球化學迴圈，同時賦予宿主新的功能，拓寬其生態位。
迄今研究最為深入的關於病毒AMGs功能的例子在海洋藍藻細菌的光合作用中，藍藻病毒光合基因psbA和psbD來源於宿主，當宿主蛋白合成因光抑制被暫停時，其編碼的D1和D2蛋白可在光損傷修復迴圈中發揮關鍵作用。
Roux等揭示了病毒可能直接參與整個海洋系統的硫和氮迴圈。
隨後的一些研究也證實了土壤病毒攜帶多種AMGs，可能影響土壤的碳過程、幫助宿主抵禦重金屬的脅迫。
需要注意的是，病毒攜帶的AMGs主要編碼不同的能量代謝路徑，宿主的翻譯和翻譯後水准調控機制等的修飾。
病毒（噬菌體）的應用
噬菌體療法已經在醫學領域使用了近1個世紀，但從未成為主流醫學方向。而由於超級細菌的出現，“噬菌體療法”的概念重新受到關注。
現時噬菌體療法在醫學中的案例還非常有限。2016年，噬菌體挽救了一比特感染了超級細菌鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）的患者；2018年，一個感染了對抗生素有耐藥性的人類分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）的女孩，在經過3種噬菌體的“雞尾酒”的治療後病情得到有效控制。
噬菌體療法在農業病害防治、畜禽養殖和食品加工中的應用則已經非常廣泛，如美國FDA準予了多種相關生物產品，分別用於治療不同農作物的細菌性斑點病、控制具有特殊食源性危害的單核細胞增多性李斯特菌、淨化活體動物從而遠離大腸桿菌和沙門氏菌以及防治幾種水果的火疫病和潰瘍病等。
國內學者在噬菌體應用方面也開展了大量研究，如利用金黃色葡萄球菌噬菌體在牛奶中的抑菌應用、假單胞菌噬菌體的篩選及在冷卻羊肉中的應用、噬菌體在多種水產養殖疾病中的應用等。
菲吉樂科等公司在動植物健康和食品安全等領域也開發了多款噬菌體產品，旨在通過噬菌體科技减少有害病原體的數量。
現時噬菌體在土壤及土傳病害方面應用的案例正逐漸嶄露頭角，如噬菌體組合應用於土傳病害青枯菌，防控蕃茄、烟草等的青枯病。
噬菌體“雞尾酒”療法是一種較好的土傳病害解決方法，它包含了不同的噬菌體組合，即使細菌對其中一個噬菌體產生抗性，仍會被其他噬菌體殺死，囙此需要積極發展土壤噬菌體資源庫的建立，推進噬菌體療法生物技術的發展。
結論
由於研究方法的限制，我們對土壤病毒的認識仍是冰山一角，未來的研究任重道遠。
如針對大量樣品的病毒研究方法的開發，以更全面地瞭解土壤病毒在大尺度上的分佈特徵；土壤病毒及病毒功能基因資源庫的建設，以便更好地服務於噬菌體產品的開發。
目前尚未發現噬菌體對人類、動物、植物有不良影響，這使得利用噬菌體特异地抑制土壤細菌污染、致病菌或耐藥菌成為可能，是一種“綠色”的生物技術。
囙此，在細菌耐藥性及後抗生素時代發展的趨勢下，噬菌體療法也有望成為抗生素的有效替代品。
作者簡介：
韓麗麗，中國科學院生態環境研究中心、都市與區域生態國家重點實驗室、中國科學院大學，副研究員，研究方向為土壤病毒生態學。
論文全文發表於《科技導報》2022年第3期，原標題為《土壤病毒的研究進展與應用前景》，本文有删减，歡迎訂閱查看。