01遇見/背景
原核細胞相比真核，大都結構簡單。比如因為缺乏細胞器，大腸桿菌常常被比作一個“茶包”：所有的酶、mRNA等生物分子無序分散在細胞膜所包裹的細胞液中。改造大腸桿菌作為細胞工廠生產生物活性分子時候也是如此。代謝工程學家通常缺乏有效的手段來調控生物酶的細胞內時空分佈。异源表達的生物酶一般認為將無序分散在細胞液中。
香港中文大學夏江教授相信調控酶的相對位置和空間分佈，將會對生物合成起到四兩撥千斤的功效。他們通過多酶組裝來改變酶的空間位置，發現將多個酶組裝在一起這一簡單操作可以大大提升生物催化的效率，提高最終產物（以萜類作為模型）的產率。比如膜定位組裝（Nat. Comm. 2019），共價組裝酶複合物（ACS Nano 2019）和以類病毒顆粒作為範本組裝（Bioconjugate Chem 2021）等多酶自組裝都實現了提升細胞內生物合成的產率。然而這些組裝管道只是機械地將多個酶結合到一起，並沒有能够有效類比天然多酶複合物的動態性：既能和外界環境快速交流，又保持相對的結構獨立性。
02遇見/內容
若論到動態又獨立的區隔管道，其中的翹楚非無膜細胞器莫屬。液-液相分離（Liquid-liquid phase separation，LLPS）是細胞內很多重要生命過程的關鍵驅動機制。細胞常常通過LLPS富集相關的生物分子，形成無膜的亞細胞結構。這些分子團聚體並非固態沉澱，而是高度聚集的（一般團聚體內部蛋白濃度大概是外部濃度的幾十至上百倍）、動態的（團聚體可以融合也可以分裂）、流動的（團聚體作為獨立的結構組織可以在細胞內流動）。這一奇特的現象在高分子物理領域和蛋白質結晶領域頗為常見，最近在細胞生物學中被廣泛報導，但在合成生物學領域仍然少有涉及。
有鑑於此，該團隊設想能否在大腸桿菌內部通過LLPS產生新的“人造細胞器”，並且通過把多個酶組裝其中來實現具有催化功能的“人造細胞器”呢？於是該團隊遵循從簡單到複雜，從胞外到胞內的原則做了如下嘗試。
作者首先通過體外重構融合相分離形成蛋白RGGRGG，雷射共聚焦顯微鏡和SDS-PAGE顯示了液液相分離的形成，相圖反應了鹽濃度和蛋白濃度對LLPS形成的影響，光漂白後的螢光恢復實驗展示了相分離的液體性質。並且證明了融合一個相互作用多肽RIAD並沒有改變RGGRGG蛋白相分離的性質。這一個工作是後續工作的最基礎的準備。
接著，作者嘗試將生物催化酶組裝進入相分離團聚體。作者選取了法尼烯生物催化過程中的兩個關鍵酶Idi和IspA，發現通過多肽相互作用把酶招募進團聚體中，FPP的產率由0.82-1.02μM/h提升到了1.58μM/h。
受此激勵，作者開始在大腸桿菌細胞內構建無膜細胞器。出乎意料，過表達RGGRGG蛋白後，在細菌中形成在普通光學顯微鏡下都可以觀察到的蛋白質團聚體，在電鏡下清晰可見。這些蛋白質團聚體證實並非固體沉澱。在經過雙光子激發顯微鏡螢光淬滅後，通過LLPS形成的團聚體仍具有螢光恢復的能力。
最後作者把Idi，IspA和AFS三個酶組裝到蛋白團聚體中，構建了多個法尼烯生產菌株。比較完全沒有蛋白團聚體的菌株和具有團聚體但沒有組裝機制的菌株，通過多肽相互作用組裝酶的團聚體菌株具有最高的法尼烯產率。這一結果最終證明調節酶的空間位置（並沒有改變單個酶的活性）可以促進級聯的生物催化反應的效率，從而獲得更高產的菌株。
本工作共同一作為香港中文大學化學系博士生王越和劉敏。香港中文大學生命科學學院薑裏文教授、香港科技大學電子與電腦工程系瞿佳男教授、香港中文大學生物醫學工程系周仁傑教授提供了顯微鏡、電鏡方面的幫助。本工作得到科技部重點專項2018YFA0903204和研究資助局課題14304921的資助。