近日，山東大學微生物科技國家重點實驗室祁慶生團隊侯進教授在Nucleic Acids Research發表“CRISPR-mediated protein-tagging signal amplification systems for efficient transcriptional activation and repression inSaccharomyces cerevisiae”，開發CRISPR轉錄調控新工具。侯進教授為論文通訊作者，研究團隊的博士生翟昊天為第一作者，山東大學為唯一完成單位和通訊作者單位。
釀酒酵母是一種重要的真核模型微生物，廣泛地應用於基礎研究和各種化學品的生產。高效、精確地控制多基因的表達，對轉錄調控極其重要。簇狀有規律間隔短回文重複序列（CRISPR）介導的轉錄調控能够實現複雜的基因表達程式設計，已廣泛用於多基因的基因表達調控。然而，現時在酵母中應用的CRISPR調控系統，通常是將核酸酶缺陷的CRISPR蛋白與轉錄啟動或抑制因數直接結合，其調控效率較低，限制了在合成生物學及代謝工程中的應用。
該工作在釀酒酵母中開發了CRISPR介導的蛋白質支架轉錄訊號擴增系統，實現了轉錄調控訊號的有效擴增，用於多基因的同時啟動和抑制。作者首先通過篩選優化CRISPR系統中的轉錄調控因數，提高調控效率；在此基礎上，創新性的在CRISPR系統中引入兩套蛋白支架系統（SPY和SunTag系統），分別用於轉錄啟動因數和抑制因數的招募，可同時將多個轉錄因數招募到核酸酶缺陷的CRISPR蛋白上，使轉錄調控效率顯著提高，實現34.9倍的轉錄啟動和95%的轉錄抑制，啟動和抑制效率分別比轉錄因數與核酸酶缺陷的CRISPR蛋白直接融合的效率提高3.8倍和8.6倍，並且啟動和抑制使用不同的CRISPR調控系統，訊號之間不串擾，實現了調控訊號的正交。在此基礎上，利用正交的雙功能CRISPR轉錄調控系統來調控3-羥基丙酸生物合成途徑的相關基因的表達，顯著提高了3-羥基丙酸的合成效率。
圖1CRISPR介導的蛋白質支架轉錄訊號擴增系統的設計原理
dCas9-SPY啟動系統及dCpf1-SunTag抑制系統的設計
現時，CRISPR介導的調控系統已廣泛用於各種轉錄調控，在基礎研究及工程化改造中都發揮了重要的作用。但調控效率低，是限制該系統的一個重要問題。本研究首次在酵母中開發了CRISPR支架蛋白介導的訊號擴增系統，通過招募轉錄因數，顯著提高轉錄調控效率，實現了多個基因表達的高效程式設計，並且通過兩套CRISPR蛋白支架調控系統的設計，實現了啟動和抑制訊號的正交，該系統比現時普遍應用的直接融合轉錄因數的CRISPR調控系統具有更好的基因調控效率，是一套新穎的CRISPR調控系統，在代謝工程和基礎研究將有廣泛的應用潜力。
文章連結：https://academic.oup.com/nar/advance-article-abstract/doi/10.1093/nar/gkac463/6596094