聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一種日常生活中十分常見的聚合物，通常作為宝特瓶、飲料瓶、水果和沙律包裝和各種家用電器的外包裝資料。現時PET廢棄物的數量佔據了全球垃圾總量的12%。且PET產品大都是一次性消費品，堆積如山的廢舊PET資料短時間內不易降解，會造成環境污染。研究人員早在2005年就發現了能够降解PET的酶，將其與下游綠色工藝相結合可以將PET單體轉化為增值的化學品，有望實現PET的永續回收。PET水解酶一般都是從微生物菌落中分離得到，但能够承受高溫高鹽環境且耐受pH的高活性PET水解酶仍然罕見。
泰國VISTEC科學技術研究所Chayasith Uttamapinant等研究人員在人類唾液中發現了一種新的聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）水解酶MG8。MG8在不同的溫度和鹽度條件下表現出强大的PET塑膠降解活性，優於一些天然存在的工程水解酶。研究團隊還將PET水解酶轉化為共價粘合劑，可用於PET的生物功能化，有望極大地擴展塑膠產品的應用領域。研究內容以Discovery and Genetic Code Expansion of a Polyethylene Terephthalate（PET）Hydrolase from the Human Saliva Metagenome for the Degradation and Bio-Functionalization of PET為題發表在《Angewandte Chemie International Edition》上。
【PET水解酶的來源】
PET作為食品包裝塑膠已有幾十年的使用歷史了，這有可能誘使人類消化系統中產生能够降解PET的水解酶。為了驗證這一推測，研究人員檢索了一個收集了不同環境來源微生物組數據的公共資料庫MGnify，MGnify中包含>140000個人類樣本和>45000個水生系統樣本，其中約75%來自海洋系統。人體體液的高鹽環境也有利於產生高耐鹽性的PET水解酶，同時在與其原生環境相似的環境溫度下保持活性。最終篩選出了7個來自海洋環境和3個來自人類微生物組的PET水解酶進行進一步的表徵分析。儘管這些水解酶都具有相似的折疊結構，但每種酶的表面電荷（包括全域電荷和局部電荷）是不同的。表面電荷的差异會極大地影響它們的底物識別能力和催化作用。MG1-MG7和MG9酶含有整體酸性表面電荷，其中MG1和MG3含有酸性活性位點，而其餘的海洋來源候選酶則具有更多的中性活性位點。MG8是一種來自人類唾液宏基因組的酶，預計表面含有許多鹼性殘基，整體等電點呈鹼性，但其活性位點是中性的。MG10來自人類皮膚微生物組，含有均勻分佈的酸性和鹼性殘留物，囙此整體接近中性，同時含有中性活性位點。
圖1.從海洋和人類宏基因組學中尋找PET水解酶的工作流程和初步表徵
【PET水解酶的表徵】
研究人員選擇大腸桿菌BL21（DE3）作為表達宿主，進一步尅隆、表達、純化和評估了MG1-MG10酶的活性。首先測試了它們水解小分子底物對苯二甲酸二（2-羥乙基）酯（BHET）的能力。MG1、MG7和MG8在水解BHET時最活躍，並且在更高的NaCl濃度下顯示出活性新增。然而，它們在37℃下的BHET水解活性最多僅IsPETase活性的27%。這表明，雖然BHET水解可能是降解PET塑膠的前提，但僅憑藉PET水解酶對小分子BHET的水解效率並不能很好地預測它們對PET塑膠的水解能力。接著研究人員著手測試PET酶水解PET粉末的效率。在37℃時，MG8降解PET粉末的效率是IsPETase的3倍。進一步優化反應溫度，當MG8在45-65℃時水解PET粉末時，TPA產量進一步提高5-7倍，MHET產量提高2倍。55℃是MG8的最佳水解溫度，該酶在其最佳條件下產生的TPA是IsPETase的83倍。MG8在降解PET方面的效能優於IsPETase。接著，進一步比較了MG8與其他工程化PETase變體的活性，MG8仍然表現出顯著的優勢，它的使用溫度更低，水解活性更高。此外，55℃低於PET結晶區的熔點。值得一提的是，迄今為止發現的所有PET水解酶在解聚高結晶PET時都存在著困難，而使用MG8降解的PET粉末結晶度基本保持不變（~30%）。
【MG8降解PET的機理】
MG8的熔化溫度（Tm）為54℃，IsPETase的熔化溫度（Tm）為42℃。這表明MG8具有更高的耐熱性。雖然預測MG8的總體pI為鹼性（9.23），但蛋白質表面仍存在著的酸性胺基酸簇以及水合鹽離子可能有助於蛋白質水合併在較高鹽濃度下維持其折疊結構和高活性。MG8的另一個特徵在於其擴展序列RYD，所有其他MG酶以及其他已知的PET水解酶都不存在此序列。從MG8中删除RYD殘留物使其PET粉末降解活性降低了5-30倍。而向IsPETase中添加RYD殘基並沒有提高IsPETase的活性，這表明該擴展序列僅能在MG8中表現出優勢。此外，在非變性條件下純化的MG8對PET粉末的水解活性比再折疊的MG8更好，但後者可以以更高的產率生產。MG8易於變性和重新折疊，同時能够保持良好的活性，有望進行大規模生產。
圖2.人唾液宏基因組中的MG8 PET水解酶高效降解PET塑膠
【PET水解酶的功能化應用】
PET具有柔韌性和可變形性，是可穿戴感測器基板資料的重要候選者。除了明確PET水解酶的降解能力以外，研究人員還驗證了MG8用作PET表面功能化工具的可行性。在MG8介導的PET水解過程中，MG8和PET之間會形成一個短暫的醯基酶中間體。使用2,3-二氨基丙酸（DAP）對MG8進行位點特异性替換，可以穩定捕獲這種中間體。加入DAP的MG8通過醯胺鍵捕獲PET，從而使所得的酶-塑膠複合物高度穩定。囙此，摻入DAP的MG8有望作為共價粘合劑與PET牢固結合，進而通過MG8（DAP）將蛋白質固定在PET上，這種管道不需要對惰性塑膠表面進行苛刻的化學處理，就可以滿足後續的加工工藝，有助於拓展基於PET的生物感測器的實際應用。研究人員還驗證了MG8（DAP）在其他脂肪族聚酯如聚丁二酸丁二醇酯（PBS）、聚己內酯（PCL）、和聚乳酸（PLA）等塑膠上的應用前景。
圖3.向MG8中加入DAP使其能够穩定地附著在PET塑膠上
【結論】
研究人員系統地探索了宏基因組數據，並從人類唾液宏基因組中鑒定了一種新的PET水解酶MG8。它是從人類宏基因組中鑒定的第一個PET水解酶，在不同的溫度和鹽度條件下表現出强大的活性，並且在PET降解效率方面優於幾種天然存在和已經工程化的PET水解酶。而通過將遺傳密碼擴展科技應用於MG8，研究人員成功地將PET水解酶轉化為PET粘合劑，可將蛋白質載體直接共價連接到PET塑膠上，無需苛刻的條件和複雜的表面處理工藝，就完成了對表面惰性PET材料的功能化。這種生物工程粘合劑成為擴展塑膠產品功能化的重要工具，極大地擴展了PET基柔性感測器的在疾病檢測等領域的傳感應用。