大家好，今天給大家介紹的文章是最近發表在Angew上的Efficient Protein-Protein Couplings Mediated by Small Molecules under Mild Conditions，文章的通訊作者是南開大學的蘇循成教授。
開發生理條件下高效的蛋白質-蛋白質偶聯方法以保持蛋白質的三維結構和功能是非常重要的。最近的研究表明，苯磺醯吡啶衍生物可以與巰基發生取代反應，而N端半胱氨酸與醛基環化形成噻唑烷則是修飾蛋白質的有效方法。受到這些研究的啟發，作者開發了一個使用5-氟-4（苯基磺醯基）吡咯醛（FPPA）介導的蛋白質偶聯方法。在FPPA中，苯磺醯和醛的吸電子作用提高了氟與游離硫醇的取代反應活性，使其明顯高於苯環醯基。
圖1.兩種FPPA介導的蛋白質偶聯模式
作者概述了兩種由FPPA介導的蛋白質偶聯方法（圖1）。一種為兩次芳香親核取代反應，第二種為取代反應加N端半胱氨酸與醛基環化反應。FPPA介導的高效蛋白質-蛋白質偶聯已在許多蛋白質中得到證實，此外作者還實現了三種生物分子的三脚架型的偶聯管道。
圖2.不同取代基的芳香烴與巰基的反應
作者首先驗證了小分子模型反應，合成了具有不同取代基的含氟芳香烴（圖2a）。作者發現化合物1-4可以與巰基發生F的取代反應而5-10不能發生，說明在該反應中磺醯基以及醛基的吸電子效應至關重要。作者也發現取代反應速率隨著pH值升高而上升（圖2b）。化合物4的F取代速率較低，而化合物1中F取代以及苯磺醯取代反應速率比較低，不能體現選擇性。考慮到醛後續可以與N端半胱氨酸環化，作者最終選擇使用化合物3（FPPA）作為偶聯試劑。
圖3.兩種偶聯模式的小分子模型反應
作者隨後驗證了FPPA的小分子模型反應。作者發現在羥胺保護、pH為8.5時，半胱氨酸可以與苯磺醯基發生取代反應。而在pH為6.5時，半胱氨酸可以專一地與醛基發生環化反應（圖3）。
作者接著評估了多種蛋白的FPPA介導的偶聯反應。首先是巰基雙取代的反應模式（圖3a i），作者使用了兩種泛素半胱氨酸突變體K63C和G76C對該反應進行驗證（圖4）。在室溫、pH為7.5以及兩當量FPPA的條件下，Ub K63C的巰基完成了F的取代反應，未觀察到其他副反應。而後續與Ub G76C的取代中，作者發現使用羥胺保護或直接反應產率均低於50%（圖4b）。作者後續加入了TECP還原劑，可以將轉化率提高至60%。
圖4.通過巰基雙取代反應實現泛素偶聯
作者隨後評估了第一步發生巰基對F的親核取代，第二步發生環化反應的偶聯模式（圖3a ii）。作者使用XIAP蛋白中的BIR3結構域作為POI1，UBA結構域作為POI2進行了偶聯反應（圖5）。結果顯示BIR3的第一步取代反應定量轉化而該結構域中與Zn2+結合的三個半胱氨酸未被修飾。BIR3_PPA與N端半胱氨酸的UBA在pH為6.5的條件下在2h內也完成了醛的環化反應。作者還發現該環化反應快與半胱氨酸小分子與醛的環化反應，作者認為這是由於蛋白質中伯胺pKa的降低使得親核反應速率新增。
圖5.BIR3與UBA結構域通過FPPA介導的偶聯
作者最後進行了三種生物分子三脚架型的偶聯嘗試。作者分別使用兩種策略（圖6），即先苯磺醯基取代後醛基環化或順序相反，最終發現先取代後環化的管道可以得到更高的轉化率（45%）。FPPA介導的在生理條件下蛋白質間的三重偶聯是製藥工業和蛋白質化學領域中一種新的方法，生成的偶聯物中三個部分通過剛性的苯環連接。作者後續也驗證了偶聯物的穩定性以及偶聯反應對蛋白質的三維結構幾乎不產生影響。
圖6.FPPA介導的三分子偶聯反應的兩種途徑
綜上所述，作者設計合成了一種FPPA小分子。在溫和條件下可以首先發生游離巰基與氟的高效取代反應，隨後再和另一分子的巰基發生苯磺醯基的取代反應或與N端半胱氨酸發生醛基的環化反應，從而實現蛋白質之間的偶聯反應。FPPA也能够以三脚架的管道實現三個大分子的偶聯反應。該體系中反應均可以在生理條件下發生並且對蛋白的三維結構不產生影響。